Шановні колеги! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою роботу. Інформую Вас, що на наступному тижні відбудуться ДВА засідання нашого семінару. 24-го червня (вівторок – типовий день для проведення семінару) о 10-30 будемо слухати доповідь наукового співр. відділу біохімії м’язів ІБХ НАНУ к.б.н. ВЕКЛІЧ Т.О. «Калікс[4]арени як селективні інгібітори катіон-транспортуючих АТР-гідролазних систем». Авторські тези доповіді додаються до цього листа. 26-го червня (четвер - нетиповий день для проведення семінару !) будемо слухати доповідь молодшого наукового співр. лабораторії сигнальних механізмів клітини ПАСІЧНИК Г.В. «Роль надекспресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у розвитку молекулярних ознак пухлинних стовбурових клітин». Авторські тези доповіді також додаються до цього листа. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі в роботі нашого семінару. З повагою – С.О.Костерін.
ТЕЗИ ДОПОВІДІ
«Калікс[4]арени як СЕЛЕКТИВНІ ІНГІБІТОРИ
катіон-транспортуючих АТР-гідролазних систем»
н.с. відділу біохімії м`язів ІБХ НАНУ к .б.н. ВЕКЛІЧ Т.О.
У забезпеченні скорочення гладеньких м`язів важлива роль належить Mg2+-залежним АТР-гідролазним ензиматичним системам. В плазматичній мембрані (ПМ), яка має селективну проникність для різноманітних речовин, міститься ряд Mg2+-залежних АТРаз, що забезпечують внутрішньоклітинний іонний гомеостаз, а саме Са2+,Mg2+-АТРаза, Nа+,К+-АТРаза та “базальна” Mg2+-АТРаза. Для подальшого дослідження іонних, молекулярних та мембранних механізмів внутрішньоклітинної сигналізації вкрай необхідним є створення нових високоефективних селективних інгібіторів та активаторів транспортних АТР-гідролаз. Це особливо стосується Са2+,Mg2+-АТРази («кальцієвої помпи») ПМ, для якої на теперішній час селективні низькомолекулярні інгібітори невідомі. У цьому аспекті, зокрема, представляють інтерес каліксарени – макроциклічні сполуки, синтезовані шляхом циклоконденсації пара-заміщених фенолів і формальдегіду. Каліксарени активно досліджуються як молекулярні платформи для дизайну сполук, здатних впливати на протікання біохімічних процесів.
Наші зусилля були спрямовані на дослідження біохімічних та фізико-хімічних закономірностей дії калікс[4]аренів на АТР-гідролазні системи плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин.
Калікс[4]арени були синтезовані, охарактеризовані методами ЯМР і ІЧ спектроскопії, та люб’язно надані нам член-кор. НАНУ В.І. Кальченком та його колегами (ІОХ НАНУ).
Експерименти були виконані на суспензії ПМ клітин міометрія, оброблених 0,1 % розчином дигітоніну, а також на клітинах міометрія. При проведенні досліджень були використані методи препаративної біохімії, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії, конфокальної мікроскопії, комп’ютерного та математичного моделювання.
Ми показали, що калікс[4]арен С-90, ефективно інгібуючи активність Са2+,Mg2+-АТРази (значення І0,5 для С-90 становить 20,2 ± 0,5 мкМ), майже не впливає на ензиматичні активності “базальної” Mg2+-АТРази і Na+,K+-АТРази. Структурний фрагмент С-150 (суто каліксаренова “платформа”) та модельна сполука М-1 (функціоналізує верхній вінець “платформи”) незначно (на 13,0 %) знижують активність Са2+,Mg2+-АТРази. Визначивши спорідненість зазначеного ензиму до АТР, іонів Mg та Са в залежності від концентрації калікс[4]арену С-90, а також його вплив на значення коефіцієнту Хілла та максимальної швидкості ензиматичного гідролізу АТР (за насичуючих концентрацій АТР, іонів Mg та Са), ми встановили, що у всіх трьох випадках спостерігалося суттєве зменшення саме максимальної швидкості гідролізу АТР; цей факт, у поєднанні з відсутністю впливу на константи спорідненості, свідчить про неконкурентний механізм інгібування калікс[4]ареном С-90 Са2+,Mg2+-АТРазної активності. За результатами конфокальної мікроскопії під впливом С-90 (20 мкМ) відбувається різке зростання флуоресцентної відповіді Са2+-чутливого зонду fluo-4 у клітині, після чого спостерігається зменшення квантового виходу зонду та повернення інтенсивності флуоресценції до початкового рівня. Ці результати свідчать про те, що калікс[4]арен С-90 індукує підвищення концентрації Са2+ у клітині, яке пов’язане зі зниженням активності Са2+,Mg2+-АТРази (кальцієвої помпи) ПМ. Зниження концентрації Са2+ до початкового рівня може бути пов’язано з залученням компенсаторних Са2+- транспортуючих систем в міоцитах до релаксації кальцієвого сигналу, які мають нижчу афінність до Са2+ та реагують, головним чином, на його високі концентрації в клітині (Са2+-уніпортер мітохондрій, Na+-Ca2+-обмінник ПМ).
На прикладі Na+,K+-АТРази ПМ ми дослідили властивості дії каліксаренів на катіон-залежний гідроліз АТР. Так, виявилося, що калікс[4]аренн С-107 (10-8-10-4 М) дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТРази (значення І0,5 становить 33 ± 4 нМ), практично не впливаючи на активність Mg2+-АТРази. Крім цього калікс[4]арен С-107, використаний у концентрації, яка відповідає значенню I0,5, істотно стимулює гальмівну дію уабаїну на питому активність Na+,K+АТРази. Модельні сполуки С-150 та М-3 («частини» каліксаренової молекули) самі по собі практично не впливають на обидві ензиматичні системи. Калікс[4]арен С-160 - регіоізомер калікс[4]арену С-107, не впливає як на Na+,K+-АТРазну, так і на Mg2+-АТРазну активності у фракції ПМ міометрія. Отже, вплив калікс[4]арену С-107 на Na+,K+-АТРазу визначається взаємним розташуванням амінофосфонових груп у молекулі калікс[4]арену, а саме відстанню між ними, яка, у випадку каліксарену С-160, є меншою, ніж у випадку калікс[4]арену С-107. Модифікація верхнього чи нижнього вінця молекули калікс[4]арену призводить до зміни ефективності інгібуючої дії на Na+,K+-АТРазну активність в ПМ клітин міометрія. Таким чином просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібувальної дії на АТРазні активності у ПМ гладеньком’язових клітин.
Дані щодо взаємодії вищезазначених калікс[4]аренів з катіон-транспортуючими АТР-гідролазами підверджуються результатами комп’ютерного моделювання із використання методів докінгу та молекулярної динаміки. Із залученням цих підходів були ідентифіковані силові взаємодії, що задіяні у стабілізації комплексів «калікс[4]арени-АТР-гідролази».
Вищенаведені експериментальні дані можуть бути корисними при подальшому з’ясуванні мембранних механізмів іонного обміну у клітинах гладеньких м’язів, зокрема, при вивченні ролі ПМ у забезпеченні електромеханічного спряження в них та контролю кальцієвого та натрієвого гомеостазу в міоцитах. Зазначені калікс[4]арени можуть бути перспективними для створення ліків нового «супрамолекулярного» покоління – регуляторів скоротливої функції гладеньких м’язів.
ТЕЗИ ДОПОВІДІ
«Роль надекспресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у розвитку молекулярних ознак пухлинних стовбурових клітин»
м.н.с. лабораторії сигнальних механізмів клітини ПАСІЧНИК Г.В.
Відповідно до сучасної фундаментальної концепції біології злоякісного росту, пухлини представлені функціонально відмінними популяціями клітин. Дослідження останніх років свідчать про те, що субпопуляції пухлинних клітин, які характеризуються здатністю до ініціювання розвитку пухлин (відомі, як ракові стовбурові клітини, CSCs, або клітини, що ініціюють пухлинний ріст, CICs), відіграють важливу роль у формуванні стійкості до хіміо- й радіотерапії та мають підвищений потенціал до метастазування. Нині, на доклінічних моделях проводяться дослідження низки фармацевтичних агентів, мішенню яких є CSCs. Поза всяким сумнівом, подальше виявлення компонентів сигнальних мереж, які регулюють біологію цих клітин, сприятиме розробці нових протипухлинних препаратів для комплексного лікування онкологічних захворювань. Метою даної роботи було з’ясувати можливий вклад адаптерного протеїну Rukl/CIN85 у розвиток молекулярних ознак CSCs та підтримання їх популяції в культурі клітин MCF-7.
За результатами проведених досліджень вперше показано, що стабільна надекспресія повнорозмірної форми адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у клітинах аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 супроводжується розвитком фенотипових і молекулярних ознак, характерних для CSCs. Зокрема, згідно отриманих даних, надекспресія Ruk/CIN85 веде до зниження інтенсивності росту клітин, підвищення їх життєздатності на пізніх етапах культивування та ефективності колонієутворення у напіврідкому агарі. При цьому, в отриманих культурах зростає кількість живих суспензійних клітин, що свідчить про зниження їх адгезивних властивостей та зростання резистентності до аноїкісу. У субклонах з високим рівнем надекспресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 зростає розмір популяції клітин, які формують сфероїди та володіють здатністю до самовідтворення. Вперше встановлено, що вміст CD44, розмір популяції клітин CD44+/CD24- та кількість клітин, що погано фарбуються толуїдиновим блакитним, асоціюються з рівнем експресії Ruk/CIN85. Продемонстровано, що надекспресія повнорозмірної форми адаптерного протеїну Ruk/CIN85 супроводжується підвищенням резистентності клітин MCF-7 до дії доксорубіцину, цисплатину, етопозиду та тамоксифену. Встановлено, що посилення хіміорезистентності клітин зі стабільною надекспресією Rukl/CIN85 корелює зі зниженням їх проліферативної активності, підвищенням стійкості до апоптозу, активацією мембранних транспортерів ABC, кіназ Src, Akt та mTOR, транскрипційного фактора NF-κB та ензиму альдегіддегідрогенази,. Використання підходів shRNA-інтерференції дозволило продемонструвати, що часткове зниження вмісту Rukl/CIN85 у стабільних трансфектантах призводить до реверсії ефектів, виявлених при надекспресії досліджуваного протеїну. Отримані дані вказують на залучення адаптерного протеїну Rukl/CIN85 до розвитку та підтримання потенціалу CSCs на моделі клітин аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF-7.