Лабораторія імунобіології

Завідувач – д.б.н. проф. Колибо Денис Володимирович

Тeл.:+(044) 2343354, E-mail:  Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Лабораторію імунобіології було створено в 2012 році в складі відділу молекулярної імунології. У складі лабораторії працюють: 1 д.б.н., 1 к.б.н., 2 м.н.с., 3 інженери (з яких - 2 аспіранти).

Найвагоміші результати за 2012-2018 рр.

Наукові дослідження лабораторії були присвячені з’ясуванню молекулярних механізмів функціонування дифтерійного токсину та його рецептору HB-EGF, а також розробці нових імунобіотехнологічних продуктів.

Дифтерійний токсин (ДТ) є основним фактором патогенності збудника дифтерії Corynebacteriumdiphtheriae. ДТ є унікальним бактеріальним протеїном, який вибірково знищує певні клітинні популяції завдяки чіткій функціональній спеціалізації доменів, що дозволяє використовувати цей токсин в білковій інженерії для конструювання рекомбінантних похідних з певними заданими властивостями. Через невеликі розміри ця молекула становить значний інтерес для створення штучних білкових молекул з транспортною функцією, наприклад, імунотоксинів. В лаборпторії розробленонизку нетоксичних рекомбінантних флуоресцентних похідних дифтерійного токсину, які можуть бути застосовані в дослідженнях рецептор-опосередкованого зв'язування і транспортування токсину в клітинах, для визначення рівня експресії на клітинах рецептора ДТ – proHB-EGF, для імунізації та одержання антитіл проти різних частин токсину, а також в розробці діагностичних тест-систем для виявлення токсину дифтерії та антитоксичних антитіл.

Субодиниця В ДТ забезпечує взаємодію з рецептором на поверхні клітини і транслокацію субодиниці А токсину з ендосоми у цитозоль чутливих клітин. Функціональні аналоги субодиниці В з флуоресцентною міткою є перспективними інструментами для вивчення згаданих вище процесів. Нами було отримано флуоресцентні аналоги субодиниці В та підтверджено специфіку їх взаємодії з чутливими до дії ДТ клітинами лінії Vero.

Було запропонувано використовувати флуоресцентні похідні субодиниці В у якості інструментів для ідентифікації рецептора proHB-EGF на поверхні клітин, а також для вивчення взаємодії і проникнення ДТ в клітину.

Рекомбінантне флуоресцентне похідне дифтерійного токсину EGFP-SbB, яке утворено шляхом заміни субодиниці А токсину на послідовність підсиленого зеленого флуоресцентного протеїну (EGFP), було використано для візуалізації взаємодії ДТ з чутливими до дії токсину клітинами мавпи лінії Vero та нечутливими клітинами миші лінії 3Т3. Було показано, що EGFP-SbB може взаємодіяти з клітинною поверхнею обох типів клітин, як чутливих до токсину, так і токсин-стійких клітин, при цьому спорідненість білка до рецепторів на клітинах лінії Vero виявилась у три рази вища у порівнянні з клітинами лінії 3Т3. Інтерналізація EGFP-SbB в клітини припинялася під дією інгібітору ендоцитозу феніларсиноксиду. Ми вважаємо, що різна чутливість до ДТ клітин мавпи і миші може бути пов'язана не тільки з відмінностями в спорідненості їх рецептора до ДТ, але й тими процесами, які відбуваються після інтерналізації токсину в клітини.

Крім того, ми порівняли внутрішньоклітинний трафік R-домену та субодиниці В (остання складалася з R-домену та Т-домену) та вивчили вплив Т-домену ДТ на внутрішньоклітинний транспорт рекомбінантних фрагментів ДТ. Використані в цій роботі рекомбінантні фрагменти ДТ були мічені різними флуоресцентними білками, що дозволило використовувати метод колокалізаціі міток. За допомогою застосування техніки конфокальної мікроскопії були виявлені відмінності в транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ в клітинах лінії Vero: R-домен транспортувався до везикулярних компартментів швидше, ніж субодиниця B. Ми вважаємо, що роль Т-домену у внутрішньоклітинному транспорті та компартменталізації токсину може бути пов'язана зі здатністю Т-домену формувати протонні канали в ендосомах та взаємодіяти з білками COPI комплексу.

B субодиниця ДТ не має каталітичної активності. Саме тому вона є нетоксичною по відношенню до нормальних клітин. Проте, оскільки субодиниця B може блокувати мітогенну активність sHB-EGF, вона може розглядатися як потенційний протипухлинний препарат. Тим не менш, її вплив на різні клітини in vitro має досліджуватись. Ми вивчили вплив B субодиниці ДТ на життєздатність чутливих клітин гістіоцитарної лімфоми лінії U937, яка експресує велику кількість sHB-EGF, та показали її цитотоксичну дію по відношенню до цих клітин. Крім того, подібний цитотоксичний ефект мав злитий білок EGFP-SbB. При цьому рекомбінантний EGFP самостійно не впливав на життєздатність клітин лінії U937. Ми вважаємо, що реалізація цитотоксичного ефекту В-субодиниці ДТ і її похідних на культурі клітин U937 відбувається в результаті індукції апоптозу через інгібування митогенної дії НВ-EGF.

Одним із важливих завдань є розробка нових in vitro методів для оцінки кількості токсин-нейтралізуючих поліклональних і моноклональних антитіл, що дозволило б уникнути використання активного дифтерійного токсину і токсин-чутливих лабораторних тварин. Нами був запропонований новий метод для виявлення протективних антитіл в сироватці, який є різновидом тесту ToBI (Toxin Binding Inhibition test – гальмування зв'язування токсину), що заснований на здатності антитоксичних антитіл інгібувати зв’язування флуоресцентної B-субодиниці токсину з клітинами лінії Vero. Новий запропонований нами підхід для оцінки антитоксичних антитіл є більш етичним та безпечним, і може успішно замінити традиційні методи тестування на тваринах.

Активна імунізація людей анатоксином широко використовується для профілактики дифтерії, а пасивна імунізація гіперімунною антитоксичною кінською сироваткою – для лікування дифтерії. Проте, дифтерійний анатоксин і кінська антитоксична сироватка мають ряд серйозних недоліків. Таким чином, пошук нових антигенів і антитіл, які можуть ефективно захистити від дифтерійного токсину, є актуальним завданням імунобіології в боротьбі з дифтерією. Ми порівняли токсин-нейтралізуючі властивості антитіл, що з’являються після імунізації лабораторних тварин рекомбінантними субодиницями А і В ДТ та продемонстрували здатність субодиниці B викликати токсин-нейтралізуючі антитіла у лабораторних тварин (кролів і морських свинок), що було підтверджено за допомогою внутрішньошкірного тесту і ToBI тесту, розробленого для цієї мети. Отримані результати свідчать, що рекомбінантна B-субодиниця ДТ здатна замінити використання анатоксину для профілактики дифтерії та може бути успішно використана для індукції захисної імунної відповіді проти ДТ.

Технології фагового дисплея – це ефективний підхід розробки імунобіотехнологічних реагентів нового покоління. Наївна мишача бібліотека одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл (ScFv) була використана для виділення ScFv, що розпізнають ДТ. Нами було створено імунну бібліотеку мишачих генів імуноглобулінів та після одного циклу відбору методом фагового дисплею виділено з неї декілька клонів ScFv антитіл, що розпізнають ДТ. Крім того, ми створили наївну бібліотеку генів імуноглобуліну людини, яка дозволила нам отримати людські ScFv до ДТ. Також нами було одержано ScFv антитiла до НВ-ЕGF, якi у подальному були використанi при створенні iмунолiпосом для спрямованої доставки лiкарських речовин в пухлини, що надекспресують онкомаркер рroHB-EGF.

Щоб оцінити дозозалежні імуногенні властивості часток полі(лактид-ко-гліколіду) (PLGA) покритих целобіозою, як носіїв антигену для пероральної імунізації, ми синтезували два типи частинок (PLGA-1, ~ 0,8 мкм і PLGA-2, ~ 1,2 мкм), що містили нетоксичну рекомбінантну субодиницю B ДТ. різні дози антигену, імобілізованого на частках вводили перорально мишам-самкам BALB/с, 3 рази з інтервалом в 2 тижні. Збільшення концентрації антитоксичних антитіл у крові було виявлено після першої імунізації. Доза антигену 250 мкг/кг була найбільш імуногенною для індукції специфічних IgG антитіл для обох типів PLGA-часток. Антигени у дозі 25 мкг/кг і 2,5 мкг/кг були найбільш імуногенні для індукції специфічних IgA антитіл PLGA-1 і 2 частками, відповідно. Таким чином, частки PLGA можна розглядати як потужні компоненти пероральних вакцин.

Білки MPT63 і MPT83, які є спільними для Mycobacterium tuberculosis та Mycobacterium bovis, через їх високу імуногенність відіграють перспективну роль у розвитку імунодіагностикумів і вакцин. Рівні антитіл до туберкуліну PPD і до антигенів MPТ63 і MPТ83 були визначені в коров'ячому стаді (94 дорослих тварин). Наші результати підтверджують, що непрямий імуноферментний аналіз з рекомбінантними білками MPТ63 і MPТ83 може бути використаний для розробки тест-систем для виявлення інфікування туберкульозом корів на рівні із вже звичним туберкуліном PPD. Для підвищення антигенних та імуногенних властивостей цих білків, фрагменти генів MPТ63 і MPТ83 були злиті, при цьому антигенні властивості отриманого рекомбінантного білка були співставні з вихідними аналогами. Анти-MPT83 і анти-MPT63 сироватки розпізнавали злитий білок MPT63-MPT83, а отже він зберігає антигенні властивості батьківських білків. Крім того, ми розробили діагностичну тест-систему проти туберкульозу великої рогатої худоби. Ця тест-система вже зареєстрована в Україні.

Найголовніші наукові проекти:

2015-2019 “Розробка засобів інгібування мітогенної активностіf heparin-binding EGF-like growth factor” ” грант НАН України

2010-2014 “Дослідження впливу мікобактеріальних білків MRT63 та MRT83 на фагоцитарні клітини” грант НАН України

2016 "Дослідження рекомбінантних фрагментів дифтерійного токсину як потенційних біофармацевтичних засобів протиракової терапії» грант Президента України, проект Фонду Фундаментальних досліджень України (F66)

Найважливіші публікації:

Публікації

  1. A.A. Siromolot, D.V. Kolibo. Putative target cells for Mycobacterium tuberculosis antigens MPT63 and MPT83. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. – 2018. – V 9, N 2. – P. 367-378.
  2. A.A. Siromolot, O.S. Oliinyk, D.V. Kolibo, A.P. Gerilovych Іmprovement and optimization of antigenic composition for serodiagnosis of tuberculosis. Journal for Veterinary Medicine, Biotechnology and Biosafety. – 2016. – V 2, N 4. – P. 11-15.
  3. A. A. Siromolot, T. A. Redchuk, O. S. Solodiankin, D. V. Kolibo, A. P. Gerilovich, S. V. Komisarenko. The Trial of Experimental Test System for the Specific Diagnostics of Cattle Tuberculosis. Biotechnologia Acta. – 2016. – V 9, N 4. – P. 14-18.
  4. Siromolot A. A., Oliinyk O. S., Kolibo D. V., Komisarenko S. V. Mycobacterium tuberculosis antigens MPT63 and MPT83 increase phagocytic activity of murine peritoneal macrophages. Ukr. Biochem. J. – 2016. – V 88, N 5. – P. 62-70.
  5. Ezepchuk Y.V., Kolybo D.V. Nobel laureate Ilya I. Metchnikoff (1845-1916). Life story and scientific heritage. Ukr Biochem J. 2016. Nov-Dec;88(6):98-109
  6. Chudina T.O., Labyntsev A.Iu., Manoilov K.Iu., Kolybo D.V., Komisarenko S.V. Cellobiose-coated PLGA particles with diphtheria toxoid for per os immunization. Croatian Medical Journal., 2015, Apr;56(2):85-93.
  7. Korotkevych N.V., Labyntsev A.J., Kolybo D.V, Komisarenko SV. The Soluble Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor Stimulates EGF Receptor Trafficking to the Nucleus.// PLoS One., 2015. 10(5): e0127887.
  8. Labyntsev A.Iu., Korotkevych N.V., Manoilov K.J., Kaberniuk A.A., Kolybo D.V., Komisarenko S.V. Recombinant fluorescent models for studying the diphtheria toxin// Bioorg Khim., 2014. 40(4), 433-442.
  9. Korotkevych N.V., Labyntsev A.Iu., Manoĭlov K.Iu., Krynina O.I., Diachenko L.O., Kolybo D.V., Komisarenko S.V. Cell model for the study of receptor and regulatory functions of human proHB-EGF.// Ukr Biokhim Zh., 2014. 86(4):69-78.
  10. Labyntsev A.Iu, Kolybo D.V., Yurchenko E.S., Kaberniuk A.A., Korotkevych N.V., Komisarenko S.V. Effect of the T-domain on intracellular transport of diphtheria toxin// Ukr Biokhim Zh., 2014. 86(3), 77-87.
  11. Kolybo D.V., Labyntsev A.J., Romaniuk S.I., Kaberniuk A.A., Oliinyk E.S., Korotkevich N.V., Komisarenko S.V. Immunobiology of diphtheria. Recent approaches for the prevention, diagnosis, and treatment of the disease.// Biotechnology, 2013. 6 (4): 43-62.
  12. Redchuk T.A., Korotkevich N.V., Gorbatiuk O.B., Gilchuk P.V., Kaberniuk A.A., Oliynyk O.S., Kolibo D.V., Komisarenko S.V. Expression of Mycobacterium tuberculosis proteins MPT63 and MPT83 as a fusion: purification, refolding and immunological characterization. // Journal of Applied Biomedicine, 2012. 10 (4): 169–176
  13. Romaniuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V. Perspectives of application of recombinant diphtheria toxin derivatives // Bioorg Khim., 2012. 38(6), 639-652.