ВІТАЄМО!
Переможці Конференції молодих учених
“Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2009”


      I.               місце
Слончак Андрій Миколайович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Клітинно-специфічні особливості регуляції транскрипції гена глутатіон S-трансферази Р1 людини.
  2.                 місце
  Чернишенко Володимир Олександрович
(Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Нова B?-фібриногеназа, як інструмент дослідження системи гемостазу.
  Олійник Олена Сергіївна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір  одноланцюгових scFv -антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину.
  3.                  місце
Басараба Ольга Іванівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Stady of RUK/CIN85 functional role in human cervical adenocarcinoma.
Редчук Тарас Анатолійович (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Клонування, експресія, очистка та антигенні властивості злитого білка, що містить послідовності антигенів MPT63 ТА MPT83 Mycobacterium tuberculosis.
  Футерник Павло Володимирович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Interaction of different mammalian tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes.
  Фляк Андрій Ігорович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Cтворення та характеристика генно-інженерних імунокон’югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та лужної фосфатази.
  Премії за активну участь у роботі конференції:
  Гриджук Олеся Сергіївна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Виділення та ідентифікація молекулярних партнерів білка PTTG.
  Климишин Дмитро Олександрович (Львівський національний університет імені Івана Франка) Конструювання плазміни pKC1139snorA::aadA для спрямованої інактивації гена snorA, імовірного активатора транскрипції генів біосинтезу ногаламіцину у  Streptomyces nogalater.
  Ковалик Леся Іванівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Investigation of Lys methylation of eEF1A1 in normal and tumor cells by the mass-spectroscopic analysis.
  Людковська Владислава Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Реконструкція in vitro комплексу eEF1B??g, що входить до складу важкої форми фактора елонгації трансляції.  

         
   
Програма та тези доповідей   конференції-конкурсу робіт молодих учених
  “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2009” 28-29 травня 2009 року Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Київ-2009
  Примітка:
  До збірки включено попередній варіант тез доповідей учасників конференції-конкурсу робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2009” в авторській редакції.

Кінцевий варіант тез буде опубліковано в “Українському біохімічному журналі” № 4 за 2009 рік. Тези доповідей молодих вчених, що не візьмуть участі у конференції, опубліковані не будуть.
 

Порядок денний Конференції молодих учених
  28 травня

  9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – Вступне слово академіка С.В.Комісаренка
10.15 – І пленарне засідання конференції
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІІ пленарне засідання конференції
17.00 – Завершення роботи першого дня конференції
   
29 травня
  9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – ІІІ пленарне засідання конференції
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІV пленарне засідання конференції
16.00 – Підведення підсумків, нагородження переможців,
закриття конференції.
ЗМІСТ
  Анісімов В.Ю. Активність препаратів Na+, K+-АТФази виділених з мозку та нирок щурів після введення комплексу вітамінів групи В                                                    5

Асмолкова В.С. Вплив N-ацилетаноламінів на показники життєздатності та процес диференціації  міогенних клітин in vitro                                                    6
Басараба О.І. Stady of RUK/CIN85 functional role in human cervical adenocarcinoma                                                                                          7
Бевза А.А. Вивчення впливу  каліксаренів С-99 та С-107 на активність АТР-ази актоміозину та субфрагменту-1 міозину                                                                            8
Верем’єва М.В. Експресія ізоформ а1 і а2 фактора елонгації трансляції eEF1 при раку шлунку людини                                                                                                        9
Горбатюк О.Б. Оптимізація очищення і ренатурації рекомбінантних білків із тілець включення E. coli з використанням металафінної хроматографії                           10
Горюшкіна Т.Б. Дослідження ефективності застосування лактат оксидази та флавоцитохрому  b2 при розробці амперометричного  біосенсора для аналізу  лактату у вині                                                                                                           11
Гриджук О.С. Виділення та ідентифікація молекулярних партнерів білка PTTG                                                                                                          12
Дворщенко К.О. Перекисне окиснення ліпідів у мітохондріях слизової оболонки шлунка щурів за умов виразки                                                                                        13
Дворщенко О.С. Протипухлинна активність ембріональних курячих антигенів і фуллерена С60                                                                                                            14
Іванов Є.Г. Стимуляция метаболизма в хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой
крови                                                                                                           15
Калинкевич О.В. Биохимическое обоснование применения композитных материалов на основе хитозана и фосфатов кальция для замещения костных дефектов                                                                                                    16
Канюка О.П. Knockout off PTTG-1 leads to impaired haemopoesis and disruption of macrophage-induced elimination of apoptotic cells and old erytrocytes in mice             17
Климишин Д.О. Конструювання плазміни pKC1139snorA::aadA для спрямованої інактивації гена snorA, імовірного активатора транскрипції генів біосинтезу ногаламіцину у  Streptomyces nogalater                                                                                                     18
Ковалик Л.І. Investigation of Lys methylation of eEF1A1 in normal and tumor cells by the mass-spectroscopic analysis                                                                   19
Курліщук Ю.В. Вплив голодування за рядом незамінних амінокислот та клітини пухлин людини різного тканинного походження                                                               20
Ларіонов В.Б. Розробка та впровадження  методів ферментативної кінетики метаболізму лікарських засобів                                                                                    21
Литвиненко І.І. Прискорення фібринолізу в присутності протеїну С  22
Людковська В.В. Реконструкція in vitro комплексу eEF1B??g, що входить до складу важкої форми фактора елонгації трансляції                                                        23
Марунич Р.Ю. Вплив доменант-негативної конструкції  6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-3 та -4 на експресію природних ізоформ цього ферменту                                                                                                    24
Наумова Н.В. Акумуляція іонів Са у деполяризованих мітохондріях міометрія.                                                                                                    25
Новосильна О.В. Дослідження характеру адсорбції ізоформ фактора елонгації трансляції 1A ссавців на поверхні з різною енергетикою                                            26
Новохацька Т.В. The expression of eukaryotic elongation factor 1 B (eEF1B) in human gastric carcinoma                                                                                                  27
Олійник О.С. Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір  одноланцюгових scFv -антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину                                                                                                       28
Павлик Ю.Я. Pretreatment of cancer cells with low doses of  transforming growth factor-B1 can enhance antitumor effect of doxorubicin                                                     29
Редчук Т.А. Клонування, експресія, очистка та антигенні властивості злитого білка, що містить послідовності антигенів MPT63 ТА MPT83 Mycobacterium tuberculosis                                                                                                 30
Руденко Я.О. Структурно-функціональний стан різних фракцій клітин СОШ при виразко утворенні                                                                                                     31
Сівко Р.В. Plasma membrane cholesterol depletion directly affects the function of synaptic vesicles, thereby altering the release and uptake of glutamate by isolated nerve terminals                                                                                                       32
Скалдін М.В. Изучение взаимодействия EphB2 рецептора с эфрином-B2 в растворе                                                                                                       33
Слончак А.М. Клітинно-специфічні особливості регуляції транскрипції гена глутатіон S-трансферази Р1 людини                                                                         34
Терлецький Б.М. Нові підходи до контролю якості імунотропних препаратів на основі інтерферону альфа та гамма                                                                     35
Федосюк С.П. Конструювання штамів неконвенційних дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis з делецією сукцинатдегідрогенази з метою покращення синтезу етанолу та дослідження їхніх біохімічний характеристик                                                                 36
Филимоненко В.П. Влияние L-аргинина на содержание ТБК-реагирующих продуктов и нитритов в тканях крыс при рабдомиолизе в условиях ингибирования гемоксигеназной активности                                                                                                    37
Фляк А.І. Cтворення та характеристика генно-інженерних імунокон’югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та лужної фосфатази                                              38
Футерник П.В. Interaction of different mammalian tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes                                                                          39
Цапенко М.В. Створення та характеристика генно-інженерних імунокон?югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та флуоресцентних білків                                       40
Чернишенко В.О. Нова B?-фібриногеназа, як інструмент дослідження системи гемостазу                                                                                                        41
Яремчук О.З. Зміни деяких окислювальних процесів у печінці при гострому панкреатиті та застосуванні L-аргініну                                                                                  42
 
УДК 577.152.3:122.5
  В.Ю. АНІСІМОВ
  АКТИВНІСТЬ ПРЕПАРАТІВ Na+, K+-АТФази ВИДІЛЕНИХ З МОЗКУ ТА НИРОК ЩУРІВ ПІСЛЯ ВВЕДЕННЯ КОМПЛЕКСУ ВІТАМІНІВ ГРУПИ В
  Одеський державний медичний університет, Одеса; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
   Вітаміни групи В приймають участь в енергетичних процесах в організмі тварин та людини на багатьох рівнях і з допомогою різних механізмів. Велику роль в них відіграє і Na+, K+-АТФаза. І хоча структура, механізми регуляції та клітинні функції Na+, K+-АТФази відображені в багатьох оглядах, в жодному з них, відсутні посилання на роботи, в яких би вивчався вплив вітамінів групи В на її активність. Проте, з нашої точки зору, між ними повинен бути досить тісний зв'язок. Так, раніше були отримані дані про те, що вітаміни групи В впливають на активність Na+, K+-АТФази в органах тварин і від цього ферменту певною мірою залежить їх транспорт через біомембрани та їх всмоктування у кишечнику (Карпов, 1994). Однак до теперішнього часу достовірно не відомо, який саме механізм змінює активність ферменту під дією вітамінів або їх комплексу.

   В експерименті використовували щурів лінії Wistar. Щурів було поділено на дві групи. Першій групі (контрольна) вводили внутрім'язово фізіологічний розчин. Другій групі (дослідна) вводили у такий же спосіб вітамінний комплекс (ВК) наступного складу (в мг на кг маси тварин): тіаміну – 6, флавінмононуклеотиду – 2, пантотенової кислоти – 25, піридоксину – 5, нікотинаміду – 20 та ліпоєвої кислоти – 2. Дози вітамінів та їх співвідношення були рекомендовані раніше Л.М. Карповим. Активність ферменту визначали через 2 години після внутрім'язового введення ВК як у гомогенатах, так і очищених ферментних препаратах. Ідентифікацію та чистоту отриманих препаратів Na+, K+-АТФази визначали методом електрофорезу.

   Встановлено, що у нормі (контроль) питома активність Na+, K+-АТФази у нирках набагато вища ніж у мозку, причому майже в однаковій мірі як для гомогенатів, так і очищених препаратів – у 3,4 та 3,8 разів, відповідно. Після ін'єкцій ВК ця закономірність виражена менше: 2,15 та 2,17 разів. Тобто ВК у більшій мірі активує Na+, K+-АТФазу мозку, чим нирок. Це просліджується як у гомогенатах, де активація становить для мозку 2,0, а для нирок – 1,29 разів, так і для очищених препаратів – 1,98 та 1,15 разів. При цьому вказана активація виразна і достовірна.

   Отримані результати свідчать про те, що питома активність ферменту істотно зростає після введення ВК як у гомогенатах, так і очищених препаратах Na+, K+-АТФази. Крім того, вітамінний комплекс у більшій мірі активує Na+, K+-АТФазу мозку, чим нирок. Механізм цієї активації ще належить вивчити, хоча біохімічне і фізіологічне значення цього факту не викликає сумніву (Карпов, 1994; Анісімов, 2005).
 

УДК 577.115.3:616-006.6
  В.С. АСМОЛКОВА, Г.Й. ЛАВРЕНЧУК
  ВПЛИВ N-АЦИЛЕТАНОЛАМІНІВ НА ПОКАЗНИКИ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ ТА ПРОЦЕС ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ МІОГЕННИХ КЛІТИН IN VITRO
  Інститут біохімії ім. О.В Палладіна Національної академії наук України,
e-mail Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Введення: N-ацилетаноламіни (NAE), група сполук ліпідної природи, разом зі специфічними рецепторами СВ1,СВ2 та GPR18, GPR55, GPR119 рецепторами,  ванілоїдними рецепторами та білками-транспортерами складає ендоканабіноїдну регуляторну систему. Окремі представники NAE характеризуються здатністю регулювати клітинний ріст і проліферацію у різних типах клітин.

Методи: досліди проведені на первинній культурі ембріональних міогенних клітин щурів. Оцінку життєздатності клітин у культурі проводили по кількості клітин на 0,05 мм2 фіксованого препарату та мітотичному індексу. Процес диференціації міогенних клітин визначали за кількістю мало- та високодиференційованих міобластів. Рівень апоптозу оцінювали за кількістю апоптотичних клітин культури у каналі протокового цитофлуориметра  FACStar Plus фірми “Becton Dickinson” (США).

Результати: життєздатність клітин неоднозначно залежить як від виду NАE, так і від їх концентрації. N-стеароїлетаноламін (NSE) (у концентрації 1 µМ та 0,1 µМ) збільшує виживання клітин та їх мітотичну активність. 10 µМ та 1 µМ NSE підвищує кількість малодиференційованих міобластів у культурі. При додаванні до культури клітин олеоїлетаноламіну (ОЕА) дозою, за прикладення якої спостерігалося зростання кількості клітин у культурі, виявилась концентрація 1 µМ. Кількість мітозів зростає за усіх концентарій ОЕА, кількість малодиференційованих міобластів є дозозалежною. При додаванні до культури клітин суміші NAE (NАEs) спостерігали інгібуючий вплив на проліферативну активність клітин у культурі, а також зменшення вмісту малодиференційованих міобластів.

Водночас, дослідження рівня апоптозу в культурі ембріональних клітин при додаванні різних видів NАE в концентрації 0,1 µМ показало, що найнижчий рівень апоптозу мають ті культури, до яких додавали NАEs.

Аналіз рівня диференціації міогенних клітин показав, що найбільше багатоядерних міосимпластів утворюється при додаванні ОЕА у концентрації 1 µМ. В інших випадках кількість міосимпластів у культурі була меншою контрольних значень. Проте, на тлі невеликої їх кількості ці міосимпласти мали розгалуджену багатоядерну структуру: кількість ядер на міосимпласт була значно вища за контрольного рівня для концентрацій 0,1 µМ для NSE та NAEs, а для ОЕА – для концентрацій 1 µМ та 10 µМ. Слід зазначити, що при додаванні до ембріональних клітин NAEs утворювалась значна кількість клітин круглої форми, а не видовженої, як у контролі, що може свідчити про порушення одного з етапів диференціації міогенних клітин. Водночас привертає увагу те, що у всіх культурах клітин спостерігаються дуже вакуолізовані клітини, найвірогідніше - жирові, що може свідчити про можливі порушення  ліпідного обміну у клітинах.  
 
УДК 577.218+616-006
 
O. BASARABA1, A. PASICHNYK 2, N. KOZLOVA 3, D. FEDOSEIENKO2, YA. BOBAK 4, L. DROBOT1
  STUDY OF RUK/CIN85 FUNCTIONAL ROLE IN HUMAN CERVICAL ADENOCARCINOMA
 
1Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
2 Taras Schevchenko National University of Kyiv, Department of Biology, Kyiv, Ukraine
3 National University of “Kyiv-Mohyla Academy” Department of Natural Sciences, Kyiv, Ukraine
4Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, Ukraine
e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Adaptor protein Ruk/CIN85 is important component of different cellular pathways and directly involved in regulation of multiple cellular functions, including proliferation, adhesion, invasion, and survival.

Using Northern blot analysis, 3.5 kb Ruk/CIN85 transcript, which encodes the full-length form of Ruk/CIN85 with molecular weight of 85 kDa (p85), was detected in the samples of total RNA isolated from both conditionally normal and neoplastic uterus tissues. The multidirectional changes in 3,5 kb Ruk/CIN85 transcript expression level were found in cancer samples in comparison with control samples, that are probably dependent on genetics context. Data of Western-blot analysis showed the predominant increase of p85 expression level in most cancer samples studied. The additional feature of Ruk/CIN85 isoforms expression patterns in uterine malignancies was the high content of p70, p40 and p34 forms while control tissue samples were characterized by the predominant increase of high molecular forms (p140, p130, p100).

 There are data that stimulation of HeLa cells with DHT lead to the activation of PI3K-dependent signaling. It was established that the content of full-length CIN85/Ruk form in Triton-X-100-soluble fraction of untreated human cervical adenocarcinoma HeLa cells in logarithmic growth phase was very low. Interestingly, stimulation of cells with DHT resulted in up-regulation of the full-length form content. The maximal effect of DHT on p85 content (10 min of stimulation) was observed at 0.01 nM of ligand concentration followed by the decrease of this effect at 30 min. The same time- and concentration-dependent changes in Ruk/CIN85 content were characteristic to IFN? and isoproterenol action. Immunoprecipitation studies identified androgen receptor (AR) as the new Ruk/CIN85 binding partner as well as changes in interaction of Ruk/CIN85 full-length form with its binding partners (AR, FAK, p85? subunit of PI3K, CD2AP, clathrin) after DHT-teratment of HeLa cells. The obtained data demonstrate partial colocalization between Ruk/CIN85 and actin in untreated HeLa cells using confocal microscopy. After DHT treatment partial redistribution of Ruk/CIN85 signal was observed. The main changes were connected with decrease of Ruk/CIN85-actin colocalization in near membrane area and corresponding accumulation of protein in perinuclear region.

The obtained results suggest that changes in the expression level as well as subcellular redistribution of Ruk/CIN85 in human cervical adenocarcinoma can lead to loss of consistent control of both apoptosis and proliferation in transformated epithelial tissue and significantly contribute to cancerogenesis and progression of cervical cancer.
 
УДК 577.152.3                                          
  А.А. БЕВЗА
  ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ КАЛІКСАРЕНІВ  С-99 ТА С-107 НА АКТИВНІСТЬ АТР-ази АКТОМІОЗИНУ ТА СУБФРАГМЕНТУ-1 МІОЗИНУ МІОМЕТРІЮ
  Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
В енергозабезпеченні процесу скорочення м`язів важлива роль належить Mg2+-залежній АТР-азі основного структурного та скоротливого компоненту гладеньком`язових клітин – актоміозиновому комплексу. Порушення скоротливої функції гладеньких м’язів міометрія лежить в основі різноманітних патологій. Розробка ефективних методів корекції порушень скоротливої активності міометрію потребує досліджень по створенню та вивченню закономірностей дії нових високоефективних сполук, здатних нормалізувати скоротливу функцію  гладеньких м’язів матки. В цьому аспекті останнім часом увага приділяється каліксаренам - циклічним олігомерам фенолів.

Метою нашої роботи було вивчити дію каліксаренів С-99 та С-107( наведені шифри) на активність АТР-ази скоротливих білків гладеньких м’язів матки та змоделювати можливу взаємодію цих сполук із функціонально активною частиною молекули міозину.

У дослідах із каталітичного титрування АТР-азної активності актоміозину міометрія каліксареном С-99 було виявлено, що в 10-20 мкМ концентрації каліксарен не впливав на ферментативний гідроліз АТР. При збільшенні концентрації - спостерігалось дозозалежне гальмування АТР-гідролазної активності (І0,5=86 ± 8 мкМ). При дослідженні концентраційної залежності впливу каліксарену С-107 на активність АТР-ази актоміозину знайдено, що активність ферменту зростала відповідно до збільшення концентрації цієї сполуки, і у випадку 100 мкМ досягала 230±12% (Ка=9,6 ± 0,7 мкМ).

У дослідах, проведених із субфрагментом-1 міозину, показано, що каліксарен С-99, починаючи із 10-20 мкМ концентрації, інгібує ферментативний гідроліз АТР. При збільшенні його концентрації спостерігалось дозозалежне гальмування АТР-гідролазної активності АТР-зи, яке у 100 мкМ концентрації сягало 77+4% відносно контролю (І0,5?43+8 мкМ). Каліксарен С-107 у діапазоні концентрацій від 10 до 100 мкМ збільшує гідроліз АТР АТР-азою відповідно до зростання концентрації каліксарену, і в 100 мкМ активує фермент більш ніж вдвічі (Ka =25+4 мкM),

Для пошуку можливого механізму взаємодії каліксарену С-99 з функціонально-активною частиною молекули міозину - голівкою, була змодельована його тривимірна структура. Також використовували просторову структуру міозину, ідентифікатор 1B7T в Protein Data Bank У залежності від умов проведеного докінгу, в активному центрі ферменту розміщували Mg2+ та (або) молекулу ATP (ADP), які необхідні для роботи АТР-ази міозину (рецептор). Проводився пошук найбільш енергетично вигідного взаємного розташування ліганду (С-99) у просторі молекули міозину (власне докінг). За результатами докінгу можна стверджувати, що каліксарен С-99 взаємодіє з функціонально-активною областю молекули міозину – ділянкою зв’язування АТР. Передбачене in silico зв’язування С-99 в активному центрі ферменту (АТР-ази) є підтвердженням отриманих результатів щодо впливу каліксарену на каталітичну активність міозину (голівки міозину) in vitro.

Автор вдячна член-кор. НАН України В.І. Кальченку та його колегам (ІОХ НАН України) за синтез та надання нам каліксаренів, а також к.б.н. Бевзі О.В за проведення докінгу каліксарену С-99 з молекулою міозину.
 
УДК 577.152.6 + 577.217
  М.В. ВЕРЕМ’ЄВА1, С.Л. ЗАЙЦЕВ2
  ЕКСПРЕСІЯ ІЗОФОРМ A1 І A2 ФАКТОРА ЕЛОНГАЦІЇ ТРАНСЛЯЦІЇ eEF1 ПРИ РАКУ ШЛУНКУ ЛЮДИНИ
  1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  2Національний інститут раку МОЗ України, Київ
  Фактор елонгації 1А (eEF1A) це важливий компонент апарату трансляції, який відіграє основну роль в трансляції генетичної інформації еукаріотної клітини та відповідає за доставку аміноацил-тРНК до А сайту рибосоми. Існує дві різні ізоформи eEF1A: eEF1A1, що присутня всюди за виключенням клітин м’язів та eEF1A2, що експресується в нормі тільки в клітинах м’язів та нейронах.

Нещодавно було показано, що поява eEF1A2 може бути пов’язана з онкогенезом в деяких тканинах людини (яєчник, молочна залоза, підшлункова залоза), де в нормі ця ізоформа відсутня. В цьому дослідженні ми мали на увазі з’ясувати принципову можливість зв’язку eEF1A2 з онкогенезом при раку шлунку людини, про що б свідчила поява цієї ізоформи фактора трансляції в клітинах пухлин. Паралельно досліджували рівень експресії ізоформи eEF1A1 в тих самих зразках.

Експресію ізоформ eEF1A було досліджено в 25 випадках кардіо-езофагеального раку в порівняні з відповідними зразками нормальної тканини шлунку. За допомогою Нозерн блот аналізу було досліджено експресію eEF1A1 і eEF1A2 на рівні мРНК,  Вестерн блот використовували для порівняльної оцінки кількості eEF1A1 в нормі і патології.

Було визначено, що експресія мРНК EEF1A2 відсутня в усіх досліджуваних зразках кардіо-езофагеального раку, що спростовує ймовірність онкогенності EEF1A2 в цьому типі раку. Експресія мРНК EEF1A1 була детектована, але не було виявлено відмінностей в рівні експресії цієї мРНК в зразках пухлинних тканин в порівнянні з умовною нормою.

Дуже цікавим виявився той факт, що, незважаючи на відсутність різниці в експресії мРНК ЕEF1A1 в нормі і патології, було виявлено значне збільшення експресії eEF1A1 на білковому рівні, що спостерігалося в 9 з 25 зразків (36%) пухлин в порівнянні з нормою. Отримані дані є першим свідченням на користь того, що не тільки поява незвичайної для даної тканини ізоформи фактора елонгації трансляції eEF1A2, але і збільшення кількості «звичайної» ізоформи eEF1A1, може бути пов’язане з канцерогенезом. Те, що збільшення кількості білку  eEF1A1 не викликано збільшенням кількості відповідної мРНК в пухлинах, може свідчити про суттєву стабілізацію цього і в нормі досить стабільного білка в пухлинних тканинах. Альтернативним поясненням може бути пов’язана з канцерогенезом позитивна регуляція синтезу цього білку на рівні трансляції. Буде обговорено можливу функцію підвищення eEF1A1 в даному типі раку.
 
УДК 577.112
О.Б.ГОРБАТЮК1, Ю.С.НІКОЛАЄВ1, Т.А.РЕДЧУК3, М.В.ЦАПЕНКО2, П.В.ГІЛЬЧУК2
  ОПТИМІЗАЦІЯ ОЧИЩЕННЯ І РЕНАТУРАЦІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ ІЗ ТІЛЕЦЬ ВКЛЮЧЕННЯ E. COLI З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТАЛАФІННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ
 
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України, Київ
3Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, Київ
  Технології рекомбінантних ДНК дозволяють клонувати цільові гени і забезпечувати їхню експресію в бактеріях E. coli. На сьогодні створено високопродуктивні системи експресії, які в  стандартних умовах ферментації забезпечують суперсинтез рекомбінантних білків на рівні до 50 % від сумарних білків клітин. Це досягається використанням для експресії клонованого гена плазміди, яка містить сильний промотор бактеріофага Т7, і відповідного штаму-реципієнту E. coli. Проблемою використання таких продуцентів є накопичення рекомбінантних білків у нерозчинному та неактивному стані - тільцях включення, що зумовлює необхідність солюбілізації білка з наступною ренатурацією in vitro для одержання функціонально-активного продукту. Оскільки процес ренатурації залишається емпіричним і у випадку індивідуальних білків потребує оптимізації de novo, розробка універсальних, технологічних, ефективних та недорогих схем ренатурації рекомбінантних білків з тілець включення є особливо актуальною. Для білків, які містять генно-інженерно введену послідовність олігогістидину (His-tag), привабливою є стратегія ренатурації на хроматографічній колонці. Іммобілізація солюбілізованого із тілець включення білка на металафінному сорбенті через послідовність His-tag дозволяє проводити очищення і ренатурацію паралельно. Ренатурація білка досягається за рахунок контрольованого зниження концентрації денатурувального реагенту і, може бути оптимізована шляхом варіювання складу буферу для ренатурації та параметрів хроматографічного процесу.

Мета роботи полягала в оптимізації схем ренатурації різних обраних для досліджень рекомбінантних білків за допомогою іммобілізаційної металафінної хроматографії (ІМАХ), та встановленні характеристик одержаних білків. У роботі були використані наступні методи: ІМАХ, культивування бактерій, експресія білків, електрофорез білків, виділення ТВ, ренатурація білків, імуноблотинг, ELISA, SEC-хроматографія, флуоресцентна мікроскопія.

Оптимізовано експресію рекомбінантних білків rSPA, rhExCD34, ScFv-mCherry, ScFv-EGFP, MPT-83, MPT-63 – MPT-83 в E. сoli, розроблено ефективні схеми їхнього одержання в очищеному і розчинному стані із тілець включення ренатурацією на металафінному сорбенті. Для ренатурованих білків досліджено вміст розчинних агрегатів, ефективність формування дисульфідних містків, функціональну активність, стабільність при зберіганні. Показано перспективність використання запропонованого нами підходу для одержання препаративної кількості очищених рекомбінантних 6His-tag білків із тілець включення та можливість ефективної ренатурації на колонці складних за структурою білків, що містять декілька доменів та дисульфідні зв’язки.
 
УДК 577.15+573.6
  Т.Б .ГОРЮШКІНА 1,2, А.П. ОРЛОВА 1,2, О.В. СМУТОК 3, С.В. ДЗЯДЕВИЧ 1
  ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ ЛАКТАТОКСИДАЗИ ТА ФЛАВОЦИТОХРОМУ b2 ПРИ РОЗРОБЦІ АМПЕРОМЕТРИЧНОГО БІОСЕНСОРА ДЛЯ АНАЛІЗУ ЛАКТАТУ У ВИНІ
  1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150, 03143, Україна; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ;
3Інститут біології клітини НАН України, м. Львів
 
Інформація про концентрацію лактату у суслі та вині, що є індикатором бактеріальної активності протягом ферментації, дозволяє контролювати та регулювати процес бродіння, покращуючи смак та якість продукту. Зручним інструментом для визначення лактату у виноробстві є біосенсор, який забезпечує проведення швидкого, достовірного та недорогого аналізу. Для розробки лактатного біосенсора використовують різні ферменти, серед яких найбільш перспективними представляються лактатоксидаза (ЛОД) та флавоцитохром b2 (ФЦ b2).

Метою даної роботи було дослідження ефективності застосування ЛОД та ФЦ b2 при розробці амперометричного біосенсора для аналізу лактату у вині. У ході роботи було створено біосенсори на основі ЛОД і ФЦ b2, іммобілізованих на поверхню електрода SensLab шляхом електрохімічної полімеризації у полі(3,4-етилендіокситіофені). На початку роботи було досліджено три препарати ФЦ b2 та обрано препарат, що демонстрував після іммобілізації найкращі робочі характеристики.

Біосенсор на основі ФЦ b2 характеризується динамічним діапазоном роботи у межах 0,2 – 6,4 мМ лактату, тоді як біосенсор з іммобілізованою ЛОД визначає 0,008 – 1 мМ субстрату. Дослідження селективності датчиків показало, що біосенсор з ФЦ b2 дає істотні неспецифічні відгуки на етанол та гліцерол, а датчик з ЛОД не реагує на інтерферуючі компоненти вина. При вивченні стабільності датчиків встановлено, що біосенсор на основі ФЦ b2 можна застосовувати для аналізів протягом принаймні трьох місяців після створення, а його оксидазний аналог зберігає достатний рівень активності лише 4 доби. Показано, що робота обох біосенсорів не залежить від величини буферної ємності та іонної сили аналізованого розчину.

Таким чином, біосенсор на основі ФЦ b2 демонструє кращу операційну стабільність та стабільність при зберіганні у порівнянні з датчиком з ЛОД. Проте за показниками чутливості та, особливо, селективності біосенсор на основі ЛОД значно перевершує аналог з іммобілізованим ФЦ b2, а саме ці параметри є вирішальними при виборі інструменту для аналізу вина та сусла – комплексних сумішей, концентрація лактату в яких часто є надзвичайно низькою.

На останньому етапі біосенсор на основі ЛОД було застосовано для кількісного визначення лактату у зразках вина, і результати аналізу корелювали з даними хроматографічного методу, тоді як результати, отримані за допомогою датчика з ФЦ b2, виявилися недостовірними. Тому використання лактатного біосенсора на основі ЛОД у виноробстві представляється більш ефективним, особливо при умові підвищення його стабільності.

При цьому біосенсор з ФЦ b2, перевагою якого є краща стабільність, можна застосовувати для аналізу інших рідин – наприклад, крові, яка не містить етанолу, а концентрація лактату у якій (0,5 – 2,2 мМ) добре вкладається в межі динамічного діапазону розробленого датчика.
 
УДК 576.535.2
  O. GRYDZHUK1, 2, Y. FILYAK1, N.BOIKO1, O. KLUCHIVSKA1, R.STOIKA1
  ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MOLECULAR PARTNERS OF PTTG PROTEIN
  1 Department of Cell Proliferation, Institute of Cell Biology, L’viv
  2 Department of Biochemistry, Ivan Franko National University of L'viv
  E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Pttg (pituitary tumor transforming gene) was discovered in 1997 as a gene overexpressed in rat pituitary tumor cells. Later its expression was detected in normal mammalian tissues (testicles, colon, small intestine etc.), however, its expression in tumor cells is usually much higher. PTTG protein (securin) is multifunctional protein, playing role in mitosis regulation, cell transformation, etc. Overexpression of PTTG protein correlates with malignant transformation and tumor formation. It is speculated PTTG to affect tumor cells via regulation of Ras and FGF production. However, the role of PTTG protein in tumorogenesis is still poor understood.

Computer analysis of aminoacid sequence of PTTG revealed potential SH3-binding proline-rich domain and DNA-binding cluster of basic aminoacids. Though, only a few molecular partners of PTTG are known at the moment. The aim of our research was to isolate and identify proteins molecular partners of PTTG.

We cloned h-pttg-1 and m-pttg-1 genes into GST-containing pGEX 5X2 plasmid, performed restriction analysis and sequencing analysis, of obtained clones. GST-fused PTTG protein (GST-PTTG) was overexpressed in E.coli BL21 cells. Isolation and purification of GST-PTTG protein was performed using Glutathione-agarose. Nonspecific binding was evaluated and minimized.  Lysates of murine L1210 cells or human L929 cells were incubated with PTTG-GST-Gluthatione-agarose, containing GST-mPTTG or GST-hPTTG, respectively. PTTG-binding proteins were collected and separated using SDS-PAGE. Protein bands were visualized using colloid Coomassie (RotiBlue). Protein bands of interest were cut, distained, dried and subjected MALDI-TOF MS/MS identification.

It was identified such proteins 80% of proteins. Among them were identified Elongation factor 2, Osteoclast-like cell cDNA, 78 kDa glucose-regulated protein precursor.

Summarizing, we identified three PTTG-binding regulatory proteins, which can be potentially involved in cancer progression regulation. Studies are in progress evaluating the functional importance of these proteins binding to PTTG protein in regulation of malignant transformation of mammalian cells.
 
УДК 577.121.7:612.353
  К.О. ДВОРЩЕНКО, Л.І. ОСТАПЧЕНКО
  ПЕРЕКИСНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У МІТОХОНДРІЯХ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЩУРІВ ЗА УМОВ ВИРАЗКИ
  Київський національний університет імені тараса Шевченка, м. Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Введення. При впливі на організм ряду несприятливих факторів, таких як стрес, алкоголь, використання нестероїдних протизапальних препаратів, можуть утворюватись симптоматичні виразки шлунка.

Одним з головних та універсальних механізмів пошкодження клітин під дією негативних впливів є порушення окисно-антиоксидантної рівноваги, яке призводить до розвитку окисного стресу. В результаті відбувається інтенсифікація процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) у мембранних структурах, таких як мітохондрії, ядра, клітинні мембрани тощо. Це в свою чергу може призвести до загибелі клітини в цілому.

Тому метою роботи було визначити вміст продуктів ПОЛ у мітохондріях слизової оболонки шлунка щурів за умов експериментальної виразки шлунка.

Методи. Досліди проводили на білих щурах лінії Вістар вагою 180-200 г. Для створення стресової виразки шлунка використовували модель іммобілізаційного водоімерсіонного холодового стресу. Для моделювання етанолової виразки шлунка використовували загальноприйнятий метод (щурам перорально вводили 1мл 96% етанолу і через годину декапітували). Мітохондрії слизової оболонки шлунка (СОШ) щурів виділяли загальноприйнятим методом. Вміст дієнових кон’югатів визначали в гептан-ізопропанольному екстракті спектрофотометричним методом, шифових основ – флюориметричним методом. Вміст ТБК-активних сполук визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними вимірами оцінювали за t-критерієм Ст’юдента.

Результати. Встановлено зростання вмісту первинних продуктів ПОЛ – дієнових кон’югатів у мітохондріальній фракції СОШ при дії стресу – на 146%, при дії етанолу – на 54% порівняно з контролем. При визначенні проміжних продуктів ПОЛ – ТБК-активних сполук у мітохондріях спостерігалось збільшення цього показника при стресовій виразці – на 89%, при етаноловій – на 115% відносно контрольних тварин. Показано зростання вмісту кінцевих продуктів ПОЛ – шиффових основ у мітохондріях СОШ: на 22% – при стресовому впливі на тварин і на 79% – при введенні етилового спирту.

Висновки. За умов експериментальної виразки у мітохондріях слизової оболонки шлунка щурів зростає інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів, що свідчить про окисне пошодження мембранних структур цих органел.
 
УДК 570.083.3:611.018.53
  О.С. Дворщенко
  ПРОТИПУХЛИННА АКТИВНІСТЬ ЕМБРІОНАЛЬНИХ КУРЯЧИХ АНТИГЕНІВ І ФУЛЛЕРЕНА С60
  Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
імені Р.Є. Кавецкого НАН України, Україна, 03022 Київ, Васильківська 45
Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. 
 
Мета: дослідити протипухлинну активність ембріональних антигенів курки (еАг) при застосуванні з нанокомплексом «фуллерен С60 -аеросил» на мишах з пухлиною карцинома легені Льюїс.

Матеріали і методи. Досліди проводили на мишах-самцях лінії С57Вl/6, яким на спину перевивали пухлину (106 кл). На 29 добу після перещеплення частині тварин хірургічно видаляли первинну пухлину і на 1, 3, 7 добу після цього їх імунізували. Використовували курячі ембріони 7-ї доби гістації. еАг (концентрація - 0,3 мг/мл) вводили по 0,3 мл/мишу, С60 (0,2 мг/курс/мишу). Проводили сорбцію еАг на С60. Співвідношення еАг/С60 = 0,3 мг білка/0,2 мг комплексу.

Групи тварин: 1 – з пухлиною; 2 – з хірургічно видаленою пухлиною (Х); 3 – без пухлини імунізовані еАг (Х+еАг) або в комбінації з С60 (Х+еАг+С60) – 4 група; 5 – імунізовані еАг і С60 (еАг+С60); 6 – одержували С60 або (еАг) – 7 група.

Імунологічні дослідження проводили на 38 добу після перещеплення пухлини. Цитотоксичну активність клітин-ефекторів визначали по відношенню  до пухлинних клітин, виділених з первинного пухлинного вузла і з метастазу в легені в МТТ-тесті.

Результати. На 38 добу після перещеплення вага первинної пухлини у групі 1 становила 1,39±0,33 гр., в 5 – 1,44±0,24 гр., в 6 – 1,01±0,23 гр. Кількість метастазів у групі 1 складала 37,5±7,4, в 2 - 22,5±7,5, в 4 – 42,7±11,7, в 5 - 39,0±8,01, в 6 - 23,6±5,4. Медіана об’єму метастазів у групі 1 склала 219,5 мм3, в 2 – 44,9 мм3, в 4 – 184 мм3, в 5 – 160,2 мм3, в 6 –6,3 мм3.

Висновки. Введення тваринам з пухлиною еАг або С60 у монорежимі призводило до найбільш вираженого гальмування метастазування і достовірного підвищення антитілозалежної цитотоксичної активності лімфоцитів до клітин виділених з первинного пухлинного вузла.
 
УДК 616.72-018.3:615361.018.5.013.8:57.043
  Е.Г. ИВАНОВ, А.К. ГУЛЕВСКИЙ
  СТИМУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА В ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ (ДО 5 кДа) КОРДОВОЙ КРОВИ
  Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков,
  E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
                 В настоящее время установлено, что скорость репаративной регенерации хрящевой ткани определяется интенсивностью метаболизма полисахаридных элементов матрикса и соединительнотканных белков, формирующих её остов. На наш взгляд, перспективными в комплексном лечении травмы хряща являются препараты, полученные из природных источников, в частности, из кордовой крови. В этом плане наиболее интересным является изучение активности низкомолекулярной (до 5 кДа) фракции, выделенной из криогемолизата кордовой крови коров (ФКК). Таким образом, целью настоящего исследования являлось изучение влияния низкомолекулярной фракции (до 5кДа) кордовой крови коров на репаративную регенерацию хряща после механической травмы.

              Выделение фракции с компонентами молекулярной массы (до 5 кДа) из кордовой крови крупного рогатого скота осуществлялось методом ультрафильтрации. Механическое повреждение хряща осуществляли наконечником бормашины. В работе осуществлялась количественная оценка состояния синтеза гликозаминогликановых,  протеогликановых и белковых компонентов хрящевой ткани биохимическими методами.

              Как известно, интенсивность регенерации хряща во многом определяется  активностью хондроцитов, синтезирующих компоненты матрикса или их посредников:  гиалуроновую кислоту, гепарин и хондроитинсульфы. Сравнивая динамику накопления в регенерате хряща гликозаминогликановых компонентов –  гепарина, хондроитинсульфатов и гиалуроновой кислоты, можно видеть, что под влиянием ФКК происходит нормализация содержания хондроитинсульфатов и гиалуроновой кислоты  уже к 28 суткам. Стимулирующий эффект ФКК относительно содержания гепарина также весьма значителен.         

               Сходная картина имела место при изучении динамики накопления протеогликановых компонентов хряща. В группе животных, получавших инъекции ФКК, содержание гексозамина в регенерате хряща уже на 7 сутки эксперимента достоверно не отличается от его содержания в хряще здоровых животных, а динамика накопления гексуроновых кислот также значительно выше, по сравнению с контролем.

                Интенсивность синтеза белковых компонентов, в частности, коллагеновых и неколлагеновых белков оценивали по содержанию, соответственно, оксипролина и тирозина в щелочном гидролизате. На 28 сутки наблюдения, содержание оксипролина в группе животных, получавших инъекции ФКК, не отличается от содержания этой аминокислоты в хрящевой ткани здоровых животных, а накопление тирозина при этом выше в 2,8 раз.

                 Таким образом, в результате проведенных экспериментов, можно сделать вывод о том, что внутримышечное введение ФКК существенно стимулирует накопление основных компонентов матрикса и белковых компонентов в регенерате хряща, что свидетельствует о значительном стимулирующем влиянии ФКК на репаративную регенерацию хряща.
 
УДК 577.1
  О.В. КАЛИНКЕВИЧ 1, А.Н. КАЛИНКЕВИЧ1, М.В. ПОГОРЕЛОВ 2, А.М. СКЛЯР 3,
Л.Ф. СУХОДУБ 1
  БИОХИМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КОМПОЗИТНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ
 
1Институт прикладной физики НАН Украины, Сумы, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Медицинский институт Сумского государственного университета, Сумы
3Сумский государственный педагогический университет им.А.С. Макаренка, Сумы
 
Для замещения костных дефектов, лечения ортопедических заболеваний и облегчения последствий травм, а также для регуляции минерального обмена и коллагенеза часто используют различные композитные материалы, включающие фосфаты кальция, коллаген, адсорбированные остеоиндуктивные факторы, различные соединения титана и алюминия или аллогенный гидроксилапатит, полученный из кости. В экспериментальных работах по изучению последствий применения указанных материалов недостаточное внимание уделяется изменениям биохимических показателей органов и тканей подопытных животных.

Целью нашей работы было изучение изменения ряда биохимических показателей сыворотки крови в процессе репаративной регенерации и при использовании для замещения костного дефекта композитных материалов на основе природного биополимера хитозана и гидроксилапатита - основного неорганического компонента кости.

Синтез композитных материалов проводили методом соосаждения. К 0,2% раствору хитозана в 1% уксусной кислоте добавляли 1М растворы CaCl2 и NaH2PO4 (соотношение Са/Р 1,67). Необходимый уровень рН поддерживали с помощью 1,25 М раствора NaOH. Продукт синтеза подвергали старению, интенсивной промывке и высушиванию.Для in vivo теста использовали линейных лабораторных крыс (48 животных) в возрасте 4 месяцев. В средней трети правой большой берцовой кости наносили сквозной дефект (диаметр 2 мм) стоматологическим бором. В экспериментальной группе дефект заполняли стержнем, сделанным из композитного материала. Животных выводили из эксперимента на 5, 10, 15 и 24 сутки после имплантации. На ряду с гистоморфологическими исследованиями были изучены изменения биохимических показателей сыворотки крови и некоторых органов и тканей в процессе репаративной регенерации без и с замещением костного дефекта. Забор крови проводили во время забоя животных. В сыворотке крови определяли содержание общего белка, белковые фракции, содержание кальция, активность АлАТ и АсАТ, активность щелочной фосфатазы, содержание аскорбиновой кислоты в сыворотке крови, надпочечниках и печени, содержание коллагена в кости, общие липиды, фосфолипиды, холестерин и продукты перекисного окисления.

Содержание общего белка, белковых фракций и щелочной фосфатазы в опытной группе не отличалось от контроля. Использование композитного материала уменьшает мобилизацию кальция, так как содержание кальция в плазме крови в опытной группе близко к норме. Также отмечена нормализация активности АсАТ в опытной группе. Содержание аскорбиновой кислоты в сыворотке крови не отличается от контроля, в то же время достоверно выше в надпочечниках и печени. К 10 суткам репаративной регенерации наблюдается более высокое содержание коллагена в костной ткани опытных животных..

Указанные биохимические изменения свидетельствуют об остеоиндуктивных свойствах композитов на основе хитозана и гидроксилапатита. Получены данные о динамике активности аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, содержания липидов и продуктов ПОЛ, антиоксидантов в процессе репаративной регенерации.
 
УДК 576.535.2
 O. KANYUKA 1,4,  S. AFANASYEV 1,4,  Y. FILYAK 1, O. FILYAK 1,3, R. STOIKA 1,
N. SYBIRNA  1
 
KNOCKOUT OFF PTTG-1 LEADS TO IMPAIRED HAEMOPOESIS AND DISRUPTION OF MACROPHAGE-INDUCED ELIMINATION OF APOPTOTIC CELLS AND OLD ERYTHROCYTES IN MICE
1Institute of Cell Biology, Drahomanov Str. 14/16, 79005, Lviv, Ukraine
2Karolinska Institutet Biomics Center, Z5:02, KS, SE-17176, Stockholm, Sweden
3Lviv State University of Vital Activity Safety, Kleparivska 35, 79000, Lviv, Ukraine
4Lviv Ivan Franko National University, Grushevskyy str. 4, 79005, Lviv, Ukraine
E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Pituitary tumor transforming gene-1 (securin) is involved in regulation of mitotic sister chromatid separation, organ development, production of angiogenic and metastatic factors. PTTG-1 protein is associated with malignant transformation, tumorigenesis, and cancer progression. Recently pttg-1 was proposed to play a role in immune system development and functioning. Knockout of pttg-1 gene (pttg-KO) caused thymus hyperplasia, spleen hypoplasia and thrombocytopenia in mice. These data suggest PTTG-1 to affect blood cells. We studied an effect of pttg-KO upon production of new blood cells and elimination erythrocytes and leukocytes cells.

We found that pttg-KO leads to significant decrease in number of neutrophils, erythrocytes and thrombocytes in murine peripheral blood, while the number of other blood cells was not affected.

We showed pttg-KO to cause elevation in number of erythrocytes with high plasma membrane electro-magnetic potential. It suggests pttg-KO-induced increase in the number of young erythrocytes in peripheral blood. Moreover, we showed slight increased in acidic resistance of erythrocytes, isolated from pttg-KO mice, comparing to WT-mice. These data were confirmed by means of erythrocytes density fractionation. However, we detected fraction of old erythrocytes in peripheral blood of pttg-KO mice. Such erythrocytes were not identified in the peripheral blood of WT mice, suggesting an effect of pttg-KO upon old erythrocytes elimination from the blood.

Histological and electron-microscopy studies were used to establish an effect of pttg-KO upon spleen and thymus development. We revealed significant increase in number of apoptotic lymphocytes and decrease in number of active macrophage in both pttg-KO spleen and pttg-KO thymus. Besides, in pttg-KO spleen it were found numerous lymphocytes with irregular nucleus, normally eliminated by macrophages in WT mice.

Summarizing, we found that pttg-1 might play an important role in regulation of haemopoesis and macrophage-dependent .

This study was executed under support of grants awarded by WUBMRC foundation.
 
УДК 575.224+577.21.
  Д.О. КЛИМИШИН1,2,  Т.П. ГРЕНЬ1, В.О. ФЕДОРЕНКО1
  КОНСТРУЮВАННЯ ПЛАЗМІДИ pKC1139snorA::aadA ДЛЯ СПРЯМОВАНОЇ ІНАКТИВАЦІЇ ГЕНА snorA, ІМОВІРНОГО АКТИВАТОРА ТРАНСКРИПЦІЇ ГЕНІВ БІОСИНТЕЗУ НОГАЛАМІЦИНУ У STREPTOMYCES NOGALATER
1Львівський національний університет імені Івана Франка, вул. Грушевського 4, Львів;
e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Інститут біології тварин УААН, вул. Стуса 38, Львів
  Введення. Міцеліальні бактерії роду Streptomyces є важливим об’єктом генетики та біотехнології, що пов’язано із їхньою здатністю синтезувати велику кількість вторинних метаболітів, провідне місце серед яких займають клінічно важливі антибіотики. Вивчення генетичного контролю біосинтезу антибіотиків є надзвичайно актуальним завданням і потребує розуміння механізмів регуляції біосинтезу цих сполук. Вирішальна роль в ініціації синтезу певного продукту вторинного метаболізму належить шлях-специфічним регуляторним білкам. Streptomyces nogalater є продуцентом протипухлинного антибіотика ногаламіцину. У результаті клонування та секвенування кластеру генів біосинтезу ногаламіцину було виявлено  ген snorA, продукт якого, імовірно, бере участь у регуляції біосинтезу цього антибіотика. Мета нашої роботи полягала у клонуванні гена  snorA методом ПЛР та дослідження його ролі у біосинтезі ногаламіцину шляхом його спрямованої інактивації в хромосомі S. nogalater.

Методи. Виділення препаратів сумарної та плазмідної ДНК, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикції, Т4-ДНК-лігазою, елюювання фрагментів ДНК з агарозного геля проводили за стандартними методиками, вказаними фірмами-виробниками ферментів. Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили з використанням ПЛР-робота MiniCycler (“MJ Research”, США). Трансформацію клітин E. coli проводили згідно стандартної “кальцієвої” методики.

Результати. З метою створення конструкції для спрямованої інактивації гена snorA, з хромосоми S. nogalater, методом полімеразної ланцюгової реакції було апліфіковано 2,5 т.п.н.-фрагмент, що містить кодуючу послідовність досліджуваного гена. Цей фрагмент було субклоновано у кон’югативному човниковому векторі pKC1139, що містить термочутливий реплікон плазміди pSG5 та ген стійкості до апраміцину. Для конструювання мутантного алеля snorA використали той факт, що в межах гена snorA, на віддалі 1700 п.н. в 3?-напрямі від його старт-кодону розташований унікальний сайт впізнавання для ендонуклеази рестрикції BamHI. В цей сайт ми клонували ген стійкості до спектиноміцину/стрептоміцину aadA з плазміди pHP45?. Таким чином на основі реплікативного вектора pKC1139 створено конструкцію, що містить  мутантний ген snorA::aadA. Цю плазміду ми перенесли  в клітини S. nogalater дикого типу за допомогою кон’югації в системі E. coli–Streptomyces. В результаті проведених схрещувань отримано апраміцин-резистентні транскон’юганти, що містили плазміду pKC1139snorA::aadA, з частотою 1,1?10-7. В подальшому буде проведено скринінг отриманих транскон’югантів з метою виявлення клонів із зруйнованим геном snorA.

Висновки. За допомогою ПЛР клоновано 2,5-фрагмент хромосоми S. nogalater, що містить ген snorA. На основі отриманого ПЛР-фрагменту сконструйовано плазміду pKC1139snorA::aadA для спрямованої інактивації досліджуваного гена.
 
УДК 577.152.6; 577.217
  L. KOVALYK 1, T. LUKASH 1, A. Orlovskiy 2, J. Debski 3
 investigatION OF lYS mETHYLATION of eEF1A1 in normal and tumor cells by the mass-spectroscopic analysis
1Institute of Molecular Biology and Genetics of NASU, Kiev, Ukraine;  Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2R.E.Kavetsky institute of experimental pathology, oncology and radiobiology of NAS of Ukraine
3Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 02-106 Warsaw, Poland
 eEF1A is one of the major components that provide translation elongation in eukaryotic cells. eEF1A*GTP catalyses codon-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of 80S ribosome. Also, eEF1A may participate in cell transformation and apoptosis, in particular, eEF1A2 has been found to be a putative oncogene in ovary, breast and pancreatic cancers.

The changes in post-translational modification status of eEF1A may play an important role in “switching on” the oncogenic effect of the elongation factor. To check this hypothesis, we analyzed post-translational modifications of eEF1A isolated from tumor (Walker rat mammary carcinoma 256) and normal (rabbit liver and muscle) cells by ESI-MS.

Samples of eEF1A were obtained by chromatografies on DEAE-cellulose and SP-sepharose. 2D electrophoresis with subsequent Western blotting were used to identify the spots of eEF1A.

Normally, 5 Lys residues are methylated in eEF1A1 molecule. For the first time we found that the methylation level of some Lys residues was changed in eEF1A1 isolated from tumor tissue. Lys 79 is trimethylated normally while the mixture of trimethyl lysine (TML), dimethyl lysine (DML) and monomethyl lysine (MML) was found in the set of the eEF1A1 molecules isolated from Walker carcinomas. Lys 165 is canonically dimethylated while the mixture of MML and DML were found at position 165 of eEF1A1 from cancer tissue.

The biological significance of methylation of non-histon proteins is very poorly understood. Apparently, methylation may modulate intra- or intermolecular interactions of the target proteins which may in turn influence various cytoplasmic processes. A possible explanation for flexible level of methylation could be the impairment of specific methylation systems during carcinogenesis. Otherwise, decreased methylation intensity might be caused by activation of a demethylase. It is especially intriguing because protein lysine demethylase has been recently shown to target non-histon proteins (Huang et al., 2007). Undermethylation or demethylation of Lys 79 and Lys 165 residues which are situated in GTP-binding domain I could affect specific activity of eEF1A in protein synthesis in cancer cells. Besides, since eEF1A has a number of binding partners in eukaryotic cell it is plausible to assume that changes of Lys methylation level could affect such interactions important for processes other than translation.
 
УДК 576
  Ю.В. КУРЛІЩУК 1,2, Б.О. ВИННИЦЬКА 2, Я.П. БОБАК 2, О.В. СТАСИК 2 
 
ВПЛИВ ГОЛОДУВАННЯ ЗА РЯДОМ НЕЗАМІННИХ АМІНОКИСЛОТ НА КЛІТИНИ ПУХЛИН ЛЮДИНИ РІЗНОГО ТКАНИННОГО ПОХОДЖЕННЯ
1 Львівський національний університет імені Івана Франка
2 Інститут біології клітини НАН України, Львів
е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Відомо, що пухлинні клітини більш чутливі порівняно з нетрансформованими клітинами до нестачі амінокислот внаслідок високого рівня метаболізму і потребують надходження їх ззовні. Наші попередні дослідження показали, що ракові клітини відрізняються чутливістю до відсутності L-аргініну у середовищі та гинуть шляхом апоптозу. Метою нашої роботи було дослідити ефекти L-метіонінового, L-лейцинового та L-лізинового дефіциту у порівнянні з відсутністю L-аргініну на злоякіснотрансформовані людські клітини. Враховуючи результати проведених досліджень, ми вибрали 3 клітинні лінії, які відрізнялись чутливістю до нестачі L-аргініну: дві чутливі – гепатокарцинома людини (HepG2) та метастатична меланома людини (WM1158), та одну резистентну – легенева аденокарцинома (A549).

Клітини інкубували на середовищі DMEM або на аналогічному середовищі без L-аргініну, L-метіоніну, L-лейцину чи L-лізину протягом 24, 48 чи 72 годин. Для визначення виживання та проліферації клітин використовували метод зафарбовування клітин трипановим синім.

Було показано, що відсутність кожної з чотирьох досліджуваних амінокислот інгібує проліферацію клітин всіх тестованих ліній. Однак, аналіз виживання клітин виявив, що дефіцит L-лейцину і L-лізину практично не впливає на життєздатність клітин протягом всього експерименту, тоді як відсутність L-метіоніну індукує загибель клітин усіх досліджуваних ліній вже після 48 годин інкубування.

На наступному етапі роботи досліджували здатність клітин відновлювати проліферацію. Для цього у безамінокислотні середовища після 24, 48 чи 72 годин інкубації додавали відповідну амінокислоту та культивували клітини ще протягом 3 днів. Як і очікувалось, А549 відновлювали проліферацію навіть після 72 годин інкубації на безаргініновому середовищі, тоді як для HepG2 і WM1158 спостерігалось часозалежне зниження відновлення росту. Відсутність L-метіоніну мала найбільш виражений вплив на злоякіснотрансформовані клітини. Клітини ліній HepG2 і WM1158 не відновлювали проліферацію навіть після 24 годин культивування на безметіоніновому середовищі. У випадку А549 спостерігалось часозалежне зниження відновлення росту клітин. Після L-лейцинового чи L-лізинового голодування ріст клітин відновлювався навіть після 72 годин інкубації на середовищі без відповідної амінокислоти у всіх досліджуваних клітинних ліній.

Отримані результати підтверджують, що голодування за L-аргініном та L- метіоніном може бути ефективним підходом для розробки нових методів комбінаційної онкотерапії. Апоптоз за умов голодування за рядом незамінних амінокислот визначається не лише їх необхідністю для синтезу білка, а й пошкодженням відповідних метаболічних шляхів, у яких ці амінокислоти задіяні.
 

УДК 577.151.121:092.9
  В.Б. ЛАРІОНОВ
  РОЗРОБКА ТА ВПРОВАДЖЕННЯ МЕТОДІВ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ КІНЕТИКИ МЕТАБОЛІЗМУ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ
  Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Зміна фармакологічної активності ліків (зменшення активності внаслідок конверсії до неактивних сполук, чи, навпаки, підвищення сили дії завдяки утворенню активних метаболітів) є загальним наслідком метаболізму ксенобіотиків у організмі. Приймаючи до уваги, що вплив цих процесів є найбільш значним при використані високоактивних сполук (наприклад, психотропних засобів), необхідним є вивчення та кількісна характеристика процесів ферментативної трансформації біологічно активних сполук – похідних 1,4—бенздіазепіну (гідазепам, феназепам та новий снодійний препарат - левана).

У роботі було синтезовано 14С-мічені аналоги препаратів гідазепаму, феназепаму та левану з ізотопною міткою у різних положеннях молекули (у гетерокільце мітка була введена конденсацією з 114С-гліцином, а у ацетоксигідразідний радикал гідазепаму – алкілуванням 114С-хлороцтовою кислотою). Радіохроматографічну чистоту та питому активність отриманих сполук визначали сполученням методів тонкошарової хроматографії та рідинної сцинтиляційної фотометрії. Кількісний вміст певних метаболітів у біологічному матеріалі (гомогенати внутрішніх органів білих мишей) визначали після попередньої екстракції радіоактивного матеріалу та хроматографії екстрактів. Встановлення або підтвердження структури метаболітів проводили за допомогою мас-спектрометрії. Індукцію або супресію певних ферментних систем in vivo (гальмування CYP2C19 та CYP3A4 або індукція CYP3A4 відповідно) здійснювали попереднім введенням кетоконазолу або фенобарбіталу.

Встановлено, що переважний напрямок та інтенсивність біотрансформації похідних 1,4-бенздіазепіну значно відрізняються у залежності від структури препарату. Так, першим етапом метаболізму феназепаму є окислення метиленової групи та утворення 3-гідроксипохідного (Кт = 2,06?10-5 М) з паралельним накопиченням похідних з гідроксилом у ароматичних кільцях (Кт = 3,67?10-5 М) та подальшим звуженням кільцю та утворенням відповідного хіназоліну. Переважним шляхом біотрансформації гідазепаму є дезалкілування з утворенням деалкілгідазепаму та оксиацетилгідразіну (з радіоактивною міткою), з наступним ароматичним гідроксилюванням. Наявність лабільної естерної групи у молекулі левани зумовлює її гідроліз та вивільнення 3-гідроксипохідного. Цей процес перебігає з різною швидкістю у мозку (Кт = 2,9?10-5 М) та плазмі (Кт = 6,4?10-5 М). Наступним етапом є не гідроксилювання ароматичних кілець, а утворення водорозчинних глюкуронових кон’югатів. В експериментах in vivo попереднє введення індукторів та інгібіторів CYP450 змінює співвідношення цих груп метаболітів.

Сполученням методів тонкошарової радіо хроматографії та мас-спектрометрії визначені переважні шляхи метаболізму похідних 1,4-бенздіазепіну у залежності від їх хімічної будови. Встановлена можливість модифікації шляхів метаболізму похідних 1,4- бенздіазепіну in vivo попереднім введенням індукторів або інгібіторів CYP450.
 
 УДК 612.115:577.151
  І.І.  ЛИТВИНЕНКО, І.І. ПАТАЛАХ
  Прискорення фібринолізу в присутності протеїну С
  Інститут біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
   Протеїн С (РС) – це попередник основного фізіологічного антикоагулянта плазми крові, активованого РС (АРС), який до того ж має важливі протизапальні, цитостатичні та профібринолітичні властивості. Втім, сучасні уявлення про біологічну роль АРС потребують певного доповнення, бо його профібринолітична функція доведена лише в дослідах з чистими білками.  Дані щодо відтворення цієї функції в умовах in vivo наразі залишаються суперечливими. На нашу думку це обумовлено не чітким дотриманням в експериментах умов, за яких можуть реалізуватись профібринолітичні властивості АРС і які, за нашою гіпотезою, мають певні обмеження. Ці умови і обмеження стосуються лише певних патологічних станів, для яких характерним є зростання рівней активатору фібринолізу t-PA (тканинний активатор плазміногену) та його інгібітору РАІ-1 (інгібітор активатору плазміногену типу 1). Зокрема, відомо що утворення повноцінного тромбу супроводжується локальним вивільненням значної кількості РАІ-1 з альфа-гранул активованих тромбоцитів, якому  передує зростання рівня t-PA, продукованого клітинами пошкодженого ендотелію. Це відбувається на фоні підвищення рівня тромбіну, який підсилює активацію РС. Непрямий вплив РС на систему фібринолізу в цих умовах відбувається через комплексоутворення активованого PC з PAI-1, що нейтралізує інгібування t-PA і, відповідно, сприяє підтримці фібринолізу. Саме тому вплив РС на систему фібринолізу можна вивчати або а) на зразках крові здорових донорів тільки після відповідного відтворення тромбогенних умов з моделюванням аномально високого накопичення РАІ-1; або б) на зразках крові хворих з тромбогенними патологіями та підвищеним вмістом цього інгібітору.

Перевіряючи своє припущення, ми провели дослідження in vitro на зразках цільної крові та цитратної плазми умовно здорових донорів (n=5), відтворюючи умови проявлення протеїном C його профібринолітичних властивостей.

   Використавши методи  візуального спостереження та фотографування динаміки лізису тромбів та фібринових згустків за різних умов, а також метод твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) для визначення концентрацій та активностей PC, PAI-1, t-PA і концентрації комплексу t-PA/PAI-1 у динаміці спостереження, ми отримали прямі докази на користь профібринолітичної ролі протеїну С, яка проявлялась лише за умов підвищеного рівня інгібітора PAI-1. Детальніше дизайн і результати досліду будуть представлені в доповіді.
 
УДК 577.122.5, 577.217.535.
  В.В. Людковська, В.Ф. Шалак
   Реконструкція in vitro комплексу eEF1B??g, що входить до складу важкої форми фактора елонгації трансляції
  Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Трансляція еукаріотичної мРНК на стадії елонгації поліпептидного ланцюга забезпечується рядом білкових факторів. Еукаріотичний фактор елонгації трансляції 1А (eEF1A) – це G-білок, який в ГТФ-асоційованій формі забезпечує зв’язування аміноацил-тРНК з А-сайтом рибосоми. Коректна кодон-антикодонова взаємодія аміноацил-тРНК в А-сайті в результаті призводить до гідролізу ГТФ з наступним вивільненням eEF1A*ГДФ з рибосоми. Відновлення активної eEF1A*ГТФ-форми відбувається за участю фактора обміну нуклеотиду (eEF1B), який складається із трьох субодиниць ?, ? та ?. Власне, субодиниці eEF1B? та eEF1B? забезпечують обмін зв’язаного з eEF1A ГДФ на ГТФ, тоді як eEF1B? вважають структурним компонентом комплексу. Комплекс цих факторів називають також eEF1H (heavy) – важкою формою фактора елонгації трансляції. Хоча раніше було запропоновано кілька моделей цього комплексу, кількісне співвідношення субодиниць у eEF1H та характер взаємодії між ними залишається достеменно не відомим.

Мала кількість eEF1H в еукаріотичній клітині не дозволяє отримати цей комплекс в препаративних кількостях, тому нами було використано бактерії-продуценти, які дають змогу отримати кожну з субодиниць в індивідуальному стані. Продукцію eEF1B? та eEF1B? в E.coli здійснювали у вигляді химерних GST-злитих білків, тоді як eEF1Bg містив послідовність шести гістидинів на N-кінці. Очищені індивідуальні рекомбінантні eEF1B? та eEF1B? субодиниці було перевірено на активність у реакції обміну нуклеотиду, зв’язаного з eEF1A.

Для швидкої візуалізації утворення комплексів між різними субодиницями ми використовували метод агарозного гель-електрофорезу в нативних умовах. При змішуванні еквімолярних кількостей кожного з компонентів можна було чітко детектувати стабільні комплекси eEF1В??, eEF1В?? та eEF1В??? за допомогою цього методу.

Ми також використовували гель-фільтрацію на Superose 6 задля оцінки молекулярної маси утворених комплексів. При індивідуальному аналізі кожної із субодиниць виявилось, що вони не відповідають очікуваним молекулярним масам, а саме: eEF1В? можна було оцінити приблизно в 72кДа, eEF1В? - 350кДа та eEF1В?- 150кДа, тоді як розрахована молекулярна маса для рекомбінантних субодиниць складала 27, 35 та 50 кДа, відповідно. Заміна стандартного буферного розчинну (150mM NaCl), що використовувався при гель-фільтрації, на розчин з високою йонною силою (0,5М NaCl), а також використання високої концентрації хаотропної солі (0,5М KSCN) не змінили профіль елюції цих білків. За попередніми висновками, ми, швидше за все, маємо справу з неглобулярними білками витягнутої форми. Використовуючи Superose 6, нам також вдалося виділити окремо подвійні eEF1В??, eEF1В?? та потрійний eEF1В??? комплекси та охарактеризувати їх субодиничний склад.

Таким чином, отримані нами індивідуальні рекомбінантні субодиниці фактора елонгації eEF1В?, eEF1В? та eEF1В? були здатними утворювати in vitro стабільний високомолекулярний комплекс, модель якого буде обговорюватись.
 
УДК 577.112:616
  Р.Ю. МАРУНИЧ, Д.О. МІНЧЕНКО, І.М. ЧУМАЧЕНКО, О.Г. МІНЧЕНКО
  ВПЛИВ ДОМЕНАНТ-НЕГАТИВНОЇ КОНСТРУКЦІЇ  6-ФОСФОФРУКТО-2-КІНАЗИ/ФРУКТОЗО-2,6-БІСФОСФАТАЗИ-3 ТА -4 НА ЕКСПРЕСІЮ ПРИРОДНИХ ІЗОФОРМ ЦЬОГО ФЕРМЕНТУ В РАКОВИХ КЛІТИНАХ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ЛІНІЇ PSN-1
  Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
                                                                                        
Фосфофруктокіназа-1 є ключовим ферментом гліколізу,  оскільки саме вона лімітує швидкість його перебігу. Цей фермент зазнає впливу з боку алостеричного регулятору — фруктозо-2,6-бісфосфату. Синтез та розщеплення фруктозо-2,6-бісфосфату, алостеричного ключового регулятора фосфофруктокінази-1, контролюється біфункціональним ферментом 6-фосфофрукто-2-кіназою/фруктозо-2,6-бісфосфатазою [6-фосфофрукто-2-кіназа (EC 2.7.1.105); фруктозо-2,6-бісфосфатаза (EC 3.1.3.46)].  (PFKFB) – ключовий фермент регуляції гліколізу.  Відомо чотири гени, що кодують синтез різних за своїми характеристиками ізоформ PFKFB (PFKFB-1, -2, -3 та -4). Експресія  PFKFB-3 та PFKFB-4 виражено активується в умовах гіпоксії та в злоякісних пухлинах. Крім того, в ракових клітинах часто виявляються сплайс-ізоформи, що мають делеції чи змінені ділянки. Саме активація  генів  PFKFB-3 та PFKFB-4 лежить в основі ефекту Варбурга і вносить суттєвий вклад у ріст злоякісних пухлин. У зв’язку з цим, нами була створена домінант-негативна конструкція PFKFB-4 та PFKFB-3 для пригнічення експресії PFKFB-4 та PFKFB-3 в ракових клітинах з метою пригнічення гліколізу та, відповідно, росту пухлинних клітин. Для цього синтезували кДНК PFKFB-3 та PFKFB-4 і в послідовність ATР-зв’язуючого домену ввели мутацію, внаслідок чого були змінені два амінокислотних залишки і був створений Pst-сайт рестрикції, що давало можливість перевіряти наявність мутації. Мутантну кДНК клонували в еукаріотичному експресійному векторі для трансфекції ракових клітин лінії PSN-1. Експресію ендогенної PFKFB-3 та PFKFB-4, а також інтенсивність росту клітин досліджували в стабільно трансфекованій домінант- негативними конструкціями PFKFB-3 або PFKFB-4 сублініях клітин PSN-1. Встановлено, що над експресія домінант-негативної конструкції PFKFB-3 чи PFKFB-4 приводить до пригнічення експресії ендогенної як PFKFB-3, так і PFKFB-4. Більше того, при цьому спостерігається також пригнічення інтенсивності росту клітин та експресії VEGF. Результати цих досліджень вказують на можливість використання домінант-негативних конструкцій PFKFB для пригнічення експресії ендогенних ізоформ PFKFB та впливу на інтенсивність росту ракових клітин. Була також проведена трансфекція клітин аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF-7 і отримані стабільно трансфековані клітини.
 
УДК 577.352.4
  Н.В.НАУМОВА, Л.Г.БАБІЧ, С.Г.ШЛИКОВ
  АКУМУЛЯЦІЯ ІОНІВ Са У ДЕПОЛЯРИЗОВАНИХ МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ
  Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України
Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Мітохондріям належить фундаментальне значення у контролі внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів і, відповідно, у забезпеченні  кальцієвої сигналізації у цитозолі. Динаміка обміну іонів Са через мітохондріальну мембрану у клітинах гладеньких м’язів, в тому числі міометрія, значною мірою контролюється електрофоретичним Са2+-уніпортером мітохондрій. Умовою функціонування уніпортеру є поляризація внутрішньої мітохондріальної мембрани. Проте є дані, що і деполяризовані мітохондрії  здатні до акумуляції іонів Са.

З метою з’ясування закономірностей обміну іонів Са в мітохондріях міометрія, були проведені дослідження рівня іонізованого Са2+ в мітохондріях, за умов їх деполяризації.

Експерименти були проведені на фракції ізольованих мітохондрій міометрія щурів з використанням проточного цитометра COULTER EPICS XLTM (Beckmam Coulter, США) і флуоресцентних зондів TMRM (tetramethylrhodaminemethyl ester, ?збуд.= 488 нм, ?фл.= 590 нм; 100 нМ) та fluo3AM (?збуд.= 488 нм, ?фл.= 520 нм, 2 мкМ) для реєстрації мітохондріального потенціалу та рівня іонізованого Са2+ відповідно.

Тестування чистоти фракції ізольованих мітохондрій проводили з використанням флуоресцентного маркеру NAO (10-nonyl acridine orange, ?збуд.=488 нм, ?фл.=525 нм, 100 нМ). Про набухання мітохондрій судили за зміщенням положення піку бокового світлорозсіювання.

Було показано, що за умов деполяризації мітохондріальної мембрани, мітохондрії здатні до акумуляції Са2+. Рівень іонізованого Са2+ у мітохондріях залежав від концентрації іонів Са у середовищі інкубації. Додавання кальцієвого іонофора A23187 разом з ЕГТА призводило до виходу Са2+ із мітохондріального матриксу. Ріанодин у різних концентраціях не впливав на рівень іонізованого Са2+ в мітохондріях. Отже, ріанодинові канали не беруть участь в акумуляції Са2+ у деполяризованих мітохондріях. Таким чином, було висловлене припущення, що акумуляція Са2+ у деполяризованих мітохондріях відбувається через H+/Ca2+-обмінник, що працює в зворотньому напрямку.

Було встановлено, що додавання в середовище інкубації іонів Mg призводить до дозозалежного збільшення рівня іонізованого Са2+ в мітохондріях. Внесення RuR також індукує підвищення рівня іонізованого Са2+ в цих субклітинних структурах. Було показано, що Mg2+ дозозалежно інгібує Са2+-індуковане набухання мітохондрій. Проте CsA не впливає на набухання мітохондрій, що виключає можливість підвищення рівня іонізованого Са2+ за рахунок блокування мітохондріальної пори перехідної провідності. Отже, зроблено припущення, що підвищення рівня іонізованого Са2+ під впливом Mg2+ та RuR спричинене блокуванням виходу іонів Са через мітохондріальний уніпортер.

Таким чином, було показано, що деполяризовані мітохондрії здатні до акумулювання іонів Са, при цьому рівень іонізованого Са2+ збільшується за умов наявності в середовищі інкубації Mg2+ та RuR.
 
УДК 577.217
В. БЛИЗНЮК1 , О. НОВОСИЛЬНА2
  ДОСЛІДЖЕННЯ ХАРАКТЕРУ АДСОРБЦІЇ ІЗОФОРМ ФАКТОРА ЕЛОНГАЦІЇ ТРАНСЛЯЦІЇ 1А ССАВЦІВ НА ПОВЕРХНІ З РІЗНОЮ ЕНЕРГЕТИКОЮ
1 - College of Engineering & Applied Sciences, Western Michigan University, USA
2 - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ   Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  В клітинах вищих еукаріотів існує дві тканиноспецифічні та високогомологічні ізоформи фактора елонгації трансляції 1А (eEF1A). Незважаючи на високу схожість амінокислотних послідовностей (98% гомологія), ці білки мають істотні функціональні відмінності. Структурні особливості, що визначають розбіжності у функціонуванні цих практично ідентичних білків залишаються невідомими.

   Структура молекул eEF1A вивчалася за допомогою атомно-силового мікроскопу (АСМ) Autoprobe CP. В якості субстратів ми використовували високо орієнтований пірографіт (гідрофобна поверхня, крім атомарних сходинок) та слюду (повністю гідрофільна поверхня).

   Показано, що ізоформа eEF1A2 має більшу спорідненість до графіту і розташовується по всій гідрофобній поверхні, в той час, коли eEF1A1 розташовується, головним чином, тільки уздовж атомарних сходинок графіту. Середній розмір найменших адсорбованих частинок складав 31 ± 3 ? для ізоформи eEF1A1 та 31 ± 2 ? для eEF1A2. 

На гідрофільній поверхні слюди також спостерігалася різна адсорбція ізоформ eEF1A. eEF1A2 - зовсім не адсорбувався, в той час коли eEF1A добре прикріплювався по всій поверхні слюди, а саме «розтягувався» на субстраті, приймаючи таку форму, при якій відбувався найбільший контакт з поверхнею. Вертикальний розмір молекули при цьому становив 18 ± 2 ?, що в два рази менше, ніж те, що спостерігалося в експериментах на графіті.

Отже, при дослідженні особливостей адсорбції на поверхні з різною енергетикою показано, що молекули ізоформ eEF1A мають різний гідрофільно-гідрофобний характер.  Більшість експонованих ділянок eEF1A2 - гідрофобні, а  eEF1A1 – гідрофільні. Крім того, молекула eEF1A1 має більш гнучку структуру і змінює свою конформацію при контакті з поверхнею, в той час коли  ізоформа eEF1A2 залишається компактною.

Ці результати добре доповнюють наші дані, отримані раніше за допомогою скануючої мікрокалориметрії та малокутового розсіювання рентгенівських променів, що свідчать про компактну форму молекули eEF1A2 і «розтягнуту» конформацію eEF1A1,  та при проведенні порівняльного аналізу здатності ізоформ взаємодіяти з біологічними лігандами. Таким чином, саме такі відмінності  eEF1A2 як компактність молекули, підвищена гідрофобність її поверхні та змінена здатність взаємодіяти із сигнальними молекулами можуть бути серед основних чинників, що забезпечують специфічну функцію цієї ізоформи eEF1A в канцерогенезі.
 
УДК 577.152.6 + 577.217
  T. NOVOKHATSKA1, S. ZAICEV2, M. VEREMIEVA1
  THE EXPRESSION OF EUKARIOTIC ELONGATION FACTOR 1 B IN HUMAN GASTRIC CARCINOMAS
 1. Institute of Molecular Biology and Genetics NASU,
150 Zabolotnogo Str., Kiev 03143, Ukraine
2. National Institute of Cancer Ministry of Health of Ukraine,
33/43 Lomonosov Str., Kiev 03022, Ukraine
  Eukaryotic translation elongation Factor 1B (eEF1В) – nucleotide exchange complex for eEF1A. It consists of three subunits: eEF1Ba, eEF1B? and eEF1B?. eEF1Ba and eEF1B? catalyze GDP-GTP exchange, eEF1B? is believed to keep all subunits of eEF1B together in the complex.

It is becoming increasingly evident that the constituents of mammalian translation machinery play important role in carcinogenesis. There are fragmentary facts in literature concerning the overexpression of mRNA for some eEF1B subunits in tumors of different localization but comparative systematic analysis of their coordinated expression during carcinogenesis has not been carried out. There is no data in literature about expression of the eEF1B in human gastric carcinoma.

Using Western blot analysis, the level of eEF1B?, eEF1B? and eEF1B? proteins expression in human gastric carcinoma and in their correspondingly paired adjacent normal tissue obtained during surgery was investigated. The expression of eEF1B? (in 50% cases) and eEF1B? (in 38% cases) was elevated more than two-fold in human gastric carcinoma compared with normal tissue. Unexpectedly, no difference in eEF1B? expression in the tumor as compared to normal gastric tissues was observed.

Thus, we found for the first time that the expression level of different subunits of eEF1B during carcinogenesis is not coordinated. Since the subunit stoichiometry in the eEF1B complex is believed to be 1:1:1 it suggests a possibility of novel cancer-related functions of eEF1B? and eEF1B? subunits of the eEF1 complex.
 
УДК 577.27:616.097
  О.С. ОЛІЙНИК, А.А. КАБЕРНЮК, Т.А. РЕДЧУК, Ю.А. ЛАБИНЦЕВ, Н.В. КОРОТКЕВИЧ, Д.В. КОЛИБО
  СТВОРЕННЯ ІМУННОЇ БІБЛІОТЕКИ ІМУНОГЛОБУЛІНОВИХ ГЕНІВ МИШІ ТА ВІДБІР ОДНОЛАНЦЮГОВИХ scFv-АНТИТІЛ, СПЕЦИФІЧНИХ ДО В СУБОДИНИЦІ ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСИНУ
  Інститут біохімії ім. А.В.Палладіна НАН України, вул. Леонтовича 9, Київ-601, 01601, Україна; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  В Україні зберігається напружена епідемічна ситуація з захворюваності на дифтерію. Аналіз статистичних даних, які наводяться ВООЗ, показує, що за кількістю випадків захворювань на дифтерію Україна належить до найбільш „проблемних” країн світу. Основним фактором патогенності та найважливішим діагностичним антигеном збудника дифтерії є дифтерійний екзотоксин. Тому існуючі імунологічні методи діагностики дифтерії направлені на пряме чи опосередковане виявлення присутності токсину в організмі пацієнта, а для терапії захворювання використовують токсин-нейтралізувальні гіперімунні сироватки.

Нами було сконструйовано бібліотеку імуноглобулінових генів миші, специфічну до дифтерійного токсину. За допомогою методу фагового дисплею було відібрано ряд продуцентів рекомбінантних одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл (scFv-антитіл) проти фрагменту В дифтерійного токсину, вісім з яких були субклоновані у векторі рЕТ-22b. Подальша характеристика відібраних scFv-антитіл показала, що вони володіють константами афінності до цільового антигену від 107 до 109 М-1 для різних клонів.

Відібрано три scFv-антитіла, що перешкоджають взаємодії між рецепторзв’язувальним фрагментом токсину та поверхнею чутливих клітин. Вірогідно ці scFv можуть нейтралізувати дифтерійний токсин, перешкоджаючи його проникненню всередину клітин-мішеней. ScFv-антитіла володіють значно меншими алергенністю та імуногенністю, ніж повнорозмірні антитіла, тому їх використання як антитоксичного препарату дозволило б значно зменшити ризик розвитку побічних реакцій при терапії дифтерії.

Своєчасна та точна діагностика є запорукою ефективного контролю над епідемічною ситуацією, разом з тим в нашій країні для діагностики, як правило, використовують морально застарілий тест на основі реакції пасивної гемаглютинації. Один з напрямків нашої роботи – розробка діагностикуму для виявлення дифтерійного токсину на основі рекомбінантних одноланцюгових антитіл. З метою спрощення детекції комплексів scFv з антигеном ми сконструювали біфункціональні гібридні білки, що містять послідовності scFv та стафілококового протеїну А.

Отож, сконструйовано імунну бібліотеку scFv-антитіл та відібрано продуценти scFv, специфічних до фрагменту В дифтерійного токсину. Отримано ряд scFv-антитіл, що володіють здатністю нейтралізувати токсин, а, отже, є перспективними претендентами на роль антитоксичних препаратів для терапії дифтерії. Запропоновано підхід – об’єднання scFv-антитіл із фрагментом білка А, що дозволяє використовувати для детекції scFv та їх комплексів з антигеном мічені антитіла довільної антигенної специфічності.

 УДК 576.32/.36+616-006.6
  J.PAVLYK1,2, Y. FILYAK2, O. FILYAK2,3, R.STOIKA2
  PRETREATMENT OF CANCER CELLS WITH LOW DOSES OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR- ?1 CAN ENHANCE ANTITUMOR EFFECT OF DOXORUBICIN
 
1 Department of Biochemistry, Ivan Franko National University of L'viv
2 Department of Cell Proliferation, Institute of Cell Biology, Lviv
3 Department of Ecological Safety, Lviv State University of Vital Activity Safety
E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Doxorubicin (adriamycin) is an anthracycline DNA-damaging anticancer drug, commonly used for treatment of cancer patients. TGF?1 (Transforming Growth Factor-?1) is a cytokine, controlling proliferation, cellular differentiation, and other functions in mammalian cells. High doses of TGF?1 can promote migration and invasiveness of malignant tumors, inducing metastasis formation. Thus, several TGF?-inducing strategies were proposed to block TGF?1 activity in patients. However, complete and prolonged blockage of TGF?1 led to decrease in affectivity of DNA-damaging drugs and loss of experimental animals’ ability of to suppress primary tumors (Kulkarni et al.- 1993, Engle et al.- 1999). It allowed speculations that low concentrations of TGF?1 can be necessary for immune system to fight against the tumor. On the other hand, low concentrations of TGF?1 were shown to inhibit double-strand breaks DNA repair system (Kanamoto et al - 2002). We presume that low concentrations of TGF?1 can inhibit DNA double strand breaks DNA-repair and strengthen anti-tumor activity of DNA damaging drug Doxorubicin.

Here we demonstrated that that TGFbeta-1 can enhance cytotoxic (pro-apoptotic) action of doxorubicin towards cultured human lung carcinoma A549 cells. Western-blot analysis and immunocytochemistry were used to show that doxorubicin induced PARP degradation in A549 cells, and TGFbeta-1 enhanced that action of the drug. Cell-colonies survival test was used to confirm TGF?1-induced enhancment of doxorubicin antitumor action with the surviving test 2 weeks after treatment. To identify the molecular mechanisms of low doses of TGF?1 action upon tumor cells, Western-blotting for caspases, pRb and other cell-death and cell-survival pathways regulative proteins were performed.

The obtained results suggest possible biomodulating effect of TGF?1 upon tumor cell treatment with doxorubicin. We also proposed possible molecular mechanism of TGF?1-induced facilitation of Doxorubicin anti-tumor action.
 
УДК 616-002.5+577.27
  Т.А. РЕДЧУК1, Н.В. КОРОТКЕВИЧ1, А.А. КАБЕРНЮК1, О.С.ОЛІЙНИК1, А.Ю. ЛАБИНЦЕВ1, О.Б.ГОРБАТЮК2, С.І.РОМАНЮК1, Д.В.КОЛИБО1
  КЛОНУВАННЯ, ЕКСПРЕСІЯ, ОЧИСТКА ТА АНТИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ЗЛИТОГО БІЛКА, ЩО МІСТИТЬ ПОСЛІДОВНОСТІ АНТИГЕНІВ MPT63 ТА MPT83 Mycobacterium tuberculosis
 1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ
  Туберкульоз є вкрай небезпечним інфекційним захворюванням, що вбиває щорічно більше 3 мільонів людей. Існуючі сьогодні методи профілактики та діагностики туберкульозу, нажаль, не є достатньо ефективними. Розробка нових діагностичних тестів, основаних на використанні рекомбінантних білків збудника туберкульозу Mycobacterium tuberculosis, в зв'язку з їх ефективністю, низькою собівартістю та безпечністю є надзвичайно актуальним напрямом в імунодіагностиці. Використання білків Mycobacterium tuberculosis MPT63 та MPT83 є перспективним  в зв'язку з високим рівнем експресії цих антигенів  в клітинах збудника та значною імуногенністю, пов'язаною з особливостями транспорту цих білків (MPT83 асоційований з клітинною стінкою патогенну, а MPT63 є секреторним).

Фрагменти генів mpt63 та mpt83 були отримані нами раніше з геному Mycobacterium bovis BCG. З метою покращення сорбційних та імуногенних властивостей антигенів нами була отримана генетична конструкція для експресії обох білків у складі однієї відкритої рамки зчитування. Для цього фрагменти mpt63 та mpt83 були об'єднані за допомогою методу SOE-PCR (полімеразна ланцюгова реакція зі з'єднанням через кінці, що перекриваються) та клоновані у векторі для експресії pET24a (Novagen). Злитий з полігістидиновим тагом білок був очищений шляхом метало-афінної хроматографії.

Для того, щоб частково охарактеризувати антигенні властивості отриманих антигенів нами були одержані поліклональні сироватки кроля проти рекомбінантних аналогів  MPT63 та MPT83, експресованих окремо. Для отриманих сироваток показана здатність розпізнавати  MPT63 та MPT83 природного походження (у очищеному туберкуліні та лізаті клітин Mycobacterium bovis BCG відповідно). Також показано, що сироватки проти MPT63 та MPT83 специфічно реагують зі злитим білком MPT63-MPT83, при відсутності перехресної специфічності. Завдяки наявності у злитому білку послідовності гену mpt83, рівень його експресії виявився на порядок вище, ніж рекомбінантного MPT63. Так, рівень експресії злитого білка складав приблизно 270 мг на літр індукованої культури Escherichia coli, в той час як кількість MPT63 складала менше 20 мг/літр. Таким чином, нами був створений химерний білок MPT63-MPT83 та охарактеризовані його антигенні властивості. Створена конструкція дозволила значно підвищити рівень експресії  послідовності антигену MPT63. Отримання злитого білка також є значно дешевшим за отримання вихідних білків окремо. Химерний білок, на нашу думку,  може бути використаний для створення або покращення антигенних композицій серологічних тест-систем та субодиничних вакцин.
 
УДК 577.611
  Я.О. РУДЕНКО, В.А. КОВАЛЬОВА, Л. І. ОСТАПЧЕНКО.
  СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН РІЗНИХ ФРАКЦІЙ КЛІТИН СОШ
  ПРИ ВИРАЗКОУТВОРЕННІ
  Київський Національний Університет імені Тараса Шевченка
  Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Незважаючи на майже столітню історію досліджень виразкової хвороби шлунка, механізм розвитку цього захворювання залишається нез’ясованим. Тому необхідні подальші дослідження і пошук нових механізмів розвитку виразки шлунка. Метою нашої роботи було провести гістологічне дослідження шлунка, визначити білково-ліпідний склад різних фракцій клітин слизової оболонки шлунка (СОШ) та дослідити ступінь деградації ДНК в ядрах клітин СОШ при стресовій та етаноловій моделях експериментального виразкоутворення.

Об’єктом дослідження були самці білих щурів лінії Вістар, віком 2-3 місяці вагою близько 200 г.

Стресову модель виразки шлунка створювали методом іммобілізаційного стресу. Етанолові виразку отримували за методом Окабе.

За умов розвитку досліджуваних моделей виразки відбуваються зміни гістологічної картини шлунка та порушення морфометричних показників клітин СОШ: зменшення площі, периметру та ядерно-цитоплазматичного співвідношення. Дослідження ліпідного складу ядерної та плазматичної мембран клітин СОШ виявило загальне зростання вмісту нейтральних ліпідів та холестеролу. Так, в ядрах вміст холестеролу підвищується в 1,3 рази при введенні щурам етанолу та в 1,8 – під дією стресу, вміст триацилгліцеролів у обох випадках зростає у 2 рази порівняно з контролем. Аналогічне зростання вмісту холестеролу в 2,9 раза, та триацилгліцеролів у 2,5 раза, відбувається у фракції плазматичних мембран за умов стресової виразки. Під дією етанолу  в мембранах клітин СОШ відбувається значне підвищення вмісту холестеролу, в той час як рівень триацилгліцеролів достовірно не змінювався. Дослідження вмісту фосфатидилетаноламіну (ФЕА), фосфатидилінозитолу (ФІ), фосфатидилхоліну (ФХ) та лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) в  ядерній фракції та фракції плазматичних мембран клітин СОШ виявило різнонаправлені зміни досліджуваних фосфоліпідів за умов експериментального виразкоутворення.

Аналіз вмісту білків ядерної фракції, фракції плазматичних мембран та цитоплазми у діапазоні 40-150 кДа не виявив змін їх якісного складу. 

Стан хроматину оцінювали за накопиченням продуктів деградації ДНК –полідезоксирибонуклеотидів – ПДН. Встановлено значне зростання ступеню деградації ДНК в ядрах клітин СОШ за умов обох експериментальних моделей виразки, на 71% при дії етанолу та на 57% при дії стресу.

На основі отриманих даних можна зробити висновок, що при дії ульцерогенних факторів, таких як етанол та «іммобілізаційний стрес» відбуваються зміни в ядерній та плазматичній мембранах, які супроводжуються утворенням розривів ДНК в клітинах СОШ, що викликає серйозні порушення їх функцій.
 

УДК 577.115.7^612.815.1
 R. V. SIVKO
  PLASMA MEMBRANE CHOLESTEROL DEPLETION DIRECTLY AFFECTS THE FUNCTION OF SYNAPTIC VESICLES, THEREBY ALTERING THE RELEASE AND UPTAKE OF GLUTAMATE BY ISOLATED NERVE TERMINALS
 
Department of Neurochemistry, Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine
 
We report that cholesterol depletion with methyl-?-cyclodextrin (M?CD) acutely applied to brain synaptosomes is accompanied by an immediate decrease in high-affinity uptake and exocytotic release of glutamate, but an increase in transporter-mediated glutamate release. clarify the possible mechanisms underlying these phenomena, we investigated the influence of M?CD on the plasma membrane potential, synaptic vesicle acidification and exo/endocytotic process in synaptosomes. We revealed that acutely applied M?CD caused the plasma membrane depolarization and the gradual leakage of protons from synaptic vesicles, as detected by rhodamine 6G and acridine orange fluorescence, respectively. Dissipation of proton gradient was coupled with dramatic decrease in exocytotic and considerable increase in transporter-mediated release of L-[14C]glutamate from cytoplasm. Cholesterol removal, however, did not block Ca2+-triggered vesicle recycling induced by high potassium depolarization. We also found that dissipation of synaptic vesicle proton gradient by M?CD, as well as bafilomycin A1, was associated with reduced L-[14C]glutamate uptake into synaptosomes suggesting the close association of the uptake process with the functional state of synaptic vesicles. We conclude that plasma membrane cholesterol depletion directly affects synaptic vesicle function resulting in redistribution of glutamate between the vesicular and the cytoplasmic pool, thereby altering the processes of release and uptake of neurotransmitters.
 
УДК 577.322.54
  М.В. СКАЛДИН1, В.П. ЗАВЬЯЛОВ1,2
  ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ EphB2 РЕЦЕПТОРА С ЭФРИНОМ-В2 В РАСТВОРЕ
 
1Херсонский государственный университет, Украина
2Университет Турку, Финляндия
 
Введение. Eph рецепторы – самый большой класс рецепторных тирозинкиназ. Их лиганды – эфрины, как и рецепторы, являются мембран-связанными молекулами, в связи с этим взаимодействуют они только в месте контакта двух клеток. При этом сигнальные каскады запускаются в обе клетки – и в лиганд-, и в рецептор-экспрессирующую. Eph-эфриновая сигнальная система играет важную роль при развитии и функционировании нервной, сосудистой, эндокринной, опорно-двигательной, иммунной систем, а также при развитии и метастазировании опухолей. Несмотря на большое число Eph рецепторов, они имеют исключительно консервативную доменную структуру. Внеклеточная часть EphB2 рецептора (EphB2-ВКЧ) состоит из N-концевого лиганд-связывающего домена (EphB2-ЛСД), цистеин-богатого домена и двух фибронектиновых доменов 3 типа (Фн3). Все эфрины содержат консервативный рецептор-связывающий домен (РСД).

Методы. Были использованы методы аналитического ультрацентрифугирования (АУЦ), флуоресцентной спектроскопии, кругового дихроизма (КД), дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и молекулярного моделирования.

Результаты. АУЦ показало, что EphB2-ВКЧ в растворе находится преимущественно в мономерной форме (76%). Расчитанная сумма спектров КД EphB2-ВКЧ и эфринаB2-РСД в дальнем ультрафиолете практически совпадает с экспериментальным спектром КД комплекса EphB2-ECP?ephrinB2. Это свидетельствует об отсутствии значительных изменений во вторичной структуре EphB2-ВКЧ и эфринаB2-РСД при формировании комплекса. Расчитанная сумма спектров флуоресценции EphB2-ВКЧ и эфринаB2-РСД имела небольшое, но достоверное, отличие от экспериментального спектра комплекса EphB2-ВКЧ?эфринB2-РСД. Это указывает на изменение микроокружения остатка (ов) триптофана, вероятнее всего Trp125 в структуре G-H петли эфрина, участвующей согласно данным рентгеноструктурного анализа в формировании комплекса. ДСК показала значительное увеличение термостабильности EphB2-ЛСД и одного из Фн3, что свидетельствует об участии этих доменов в димеризации рецепторов.

Выводы. При формирования функционального димера в структуре Eph рецепторов не происходит значительных изменений. Однако согласно ДСК в процессе димеризации участвуют все домены ВКЧ рецептора. Была создана модель вероятного механизма активации Eph рецепторов, согласно которой домены интактного рецептора формируют внутримолекулярные низкоаффинные гетерокомплексы, а после связывания эфрина формируются межмолекулярные гомокомплексы. Предложенная модель объясняет механизм димеризации в случае, когда Eph-ЛСД и эфрин-РСД формируют в растворе и в кристалле только димеры.
 
УДК 577.152.28
  A. SLONCHAK 1, A. CHWIEDUK 2, J. RZERZOWSKA-WOLNY 2, M. OBOLENSKA 1
  CELL-SPECIFIC FETCHERS OF THE HUMAN GLUTATHIONE S-TRANSFERASE P1 GENE TRANSCRIPTION REGULATION
 1Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, Kyiv;  Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2M. Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology in Gliwice, Gliwice
  Introduction. Glutathione S-transferase P1-1 is a major phase II detoxification enzyme. Although the regulation of GSTP1 gene expression is in the focus of many researchers, cell-specific mechanisms of its regulation are poorly understood. To clarify these mechanisms we assessed the CpG methylation of the promoter region and analyzed cis- and trans-acting factors involved in regulation of its transcription in cells possessing different GSTP1 levels.

Methods. In cultured cells levels of GSTP1 mRNA were assessed be qRT-PCR and levels of GSTP1 protein were assessed by Western-blotting. Promoter methylation was analyzed by methylation-specific PCR (MSP). Truncated promoter fragments for the transient transfection were obtained by PCR and cloned into pGL3basic. Resulted constructs were transfected to the cells and relative luciferase activities were measured. Transcription factors were identified by competitive EMSA (electrophoretic mobility shift assay) and supershift analysis.

Results. Hbl-100, Me45 and BeWo cells, possessing different levels of GSTP1 mRNA and protein, were selected for the experiment. The highest level of GSTP1 expression was detected in Hbl-100 and the lowest in BeWo. MSP revealed partial GSTP1 promoter methylation in Me45 and BeWo cells and no methylation in Hbl-100. Transient transfection assay provided the evidence for two positive (ARE and NF-?B) and two negative (CRE and NF-?B-like) regulatory elements similarly acting in GSTP1 promoter in all cell types analyzed. EMSA indicated that ER? together with unidentified protein binds to GSTP1 ARE and together with Fos binds to CRE in all cell types, although the structure of ER?/Fos complex in Hbl-100 differs from that in Me45 and BeWo. In addition NF-?B interacting with GSTP1 NF-?B site was identified as a p50/p50 homodimer in BeWo and p50/p65 heterodimer in Hbl-100 and Me45cells.

Conclusions. Thus, we analyzed for the first time the molecular mechanisms responsible for the steady-state level of GSTP1 transcription in Hbl-100, Me45 and BeWo cells. The obtained results clearly indicate that promoter methylation and transcription factors are responsible for the cell-specific levels of GSTP1 expression in these cells. We assume that CpG methylation accounts for the lower GSTP1 expression level in Me45 and BeWo comparing to Hbl-100 cells, while further down-regulation observed in BeWo results from the absence of NF-?B p65 transactivating subunit in this cell type. We also demonstrated for the first time that crosstalk between ER? and other transcription factors occurs in regulation of GSTP1 transcription.
 
УДК 577.112.083
  Б.М. ТEРЛЕЦЬКИЙ 1,3, К. АЛІБЕК 2, О.Г. МІНЧЕНКО3
  НОВІ ПІДХОДИ ДО КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ІМУНОТРОПНИХ ПРЕПАРАТІВ НА ОСНОВІ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА ТА ГАММА
 1 Київський національний університет ім. Т. Шевченка, біологічний факультет, Київ, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2 AFG Biosolutions, Гейтерсбург, Меріленд, США.
3 Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
  Основним показником якості біотехнологічних препаратів на основі рекомбінантних білків є їх біологічна активність, що є відображенням терапевтичної ефективності лікарських препаратів на їх основі. Стандартизація методів контролю якості лікарських засобів та їх окремих ланок у відповідності до європейських вимог є необхідною вимогою системи норм GMP, що введені в українську фармацевтичну практику. В Україні ще відсутні національні стандарти інтерферону (ІФН)-гамма чи ІФН-альфа. Встановлено, що активність єдиного доступного на ринку України стандарту ІФН-гамма (NIBSС, Англія) відрізняється від міжнародного стандарту ВОЗ більш ніж у 3 рази. Активність препарату Інгарон (ІФН-гама), виробництва Фармаклон (Росія), закупленого на ринку України, становить лише 30% вказаної дози. Контроль активності препаратів ІФН-альфа в Україні ускладнюється відсутністю сертифікованого вірусу везикулярного стоматиту штаму Індіана АТС VR158, що затверджений європейською фармакопеєю для тестування активності інтерферонів. У зв’язку з цим нами розроблений альтернативний метод виявлення активності препаратів ІНФ-альфа на основі люциферазної репортерної системи, що характеризується дозо-залежною лінійністю в широкому діапазоні. Даним методом проведений вибірковий аналіз препаратів  ІФН-альфа існуючих на ринку України та експериментальних препаратів виробництва Макс-велл. Отримані результати свідчать про високу варіабельність реальних значень активності препаратів, що продаються на ринку України, що може бути результатом низької точності класичного противірусного методу, котрий використовується виробниками згідно рекомендації фармакопеї. Таким чином, розроблений нами метод контролю активності  ІФН може замінити існуючий  противірусний метод. Активність експериментальних препаратів ІФН-альфа виробництва Макс-велл характеризувалися меншим відхиленням від встановлених дозувань у порівнянні з їх аналогами.

 УДК 579.222.6
  С. П. ФЕДОСЮК, А. А. СИБІРНИЙ
  КОНСТРУЮВАННЯ ШТАМІВ НЕКОНВЕНЦІЙНИХ ДРІЖДЖІВ HANSENULA POLYMORPHA ТА PICHIA STIPITIS З ДЕЛЕЦІЄЮ СУКЦИНАТДЕГІДРОГЕНАЗИ З МЕТОЮ ПОКРАЩЕННЯ СИНТЕЗУ ЕТАНОЛУ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХНІХ БІОХІМІЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК
  Інститут біології клітини НАН України, вул. Драгоманова 14/16, м. Львів 79005, Україна
e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Серед актуальних проблем сьогодення є пошук відновлюваних джерел енергії, які могли б замінити викопне паливо. Етанол може бути використаний як паливо для двигунів внутрішнього згорання. Синтез етанолу може здійснюватися за допомогою біотехнологічних підходів, використовуючи дешеву сировину рослинного походження (основний складник - лігноцелюлоза) та певні мікроорганізми. До видів дріжджів, що здатні синтезувати етанол, зброджуючи мономери лігноцелюлози глюкозу і кcилозу, належать неконвенційні дріжджі Hansenula polymorpha та Pichia stipitis. Здатність дріжджів до алкогольної ферментації ксилози є важливою характеристикою, оскільки у деяких випадках вміст ксилози у рослинній біомасі досягає 30% від загальної маси.

Метилотрофні дріжджі H. polymorpha здатні до алкогольної ферментації цукрів за умов високої температури (до 50 оС), а дріжджі P. stipitis належать до найкращих природних ферментаторів ксилози. Проте дихальний метаболізм цих видів дріжджів робить процес алкогольної ферментації залежним від умов аерації клітин, це ускладнює технологію та робить її менш ефективною. Порушивши окисний метаболізм клітини, можна покращити рівень синтезу етанолу. Одним із підходів є пошкодження дихального окислення субстратів на рівні циклу Кребса, центральним ферментом якого є сукцинатдегідрогеназа (SDH).

Ми сконструювали штами H. polymorpha та P. stipitis з делецією каталітичної субодиниці SDH, яка кодується SDH1 геном, генотип штамів був підтверджений гібридизацією за Саузерном. Делеційні штами не здатні до росту на дихальних субстратах, зокрема ксилозі, етанолі та гліцеролі, дихання в них суттєво знижене в порівнянні з диким типом, сукцинатдегідрогеназна активність у безклітинних екстрактах відсутня. Встановлено, що нагромадження етанолу у середовищі з глюкозою та ксилозою отриманими штамами відбувалося на 10-30% менше в порівнянні зі штамом дикого типу. Незважаючи на делецію лише одного гена, мутантні ?sdh1 штами H. polymorpha та P. stipitis характеризувалися суттєвими фізіологічними відмінностями. За умов повної аерації швидкість росту Hp?sdh1 штаму була на третину нижчою, ніж у дикого типу, а Ps?sdh1 починали рости на 2 добу експерименту і нагромаджували лише п’яту частину від кількості біомаси штаму дикого типу.

Ми провели аналіз метаболітів у середовищі росту і виявили, що ?sdh1 мутанти в умовах повної аерації нагромаджували етанол (0,8-2 г/л), сукцинат (0,5 г/л) та ацетат ( 2 г/л), причому штами дикого типу такі метаболіти не нагромаджували взагалі. Для з’ясування ланки вуглецевого метаболізму, відповідального за нагромадження ацетату, було проведено оцінку рівня транскрипції генів альдегіддегідрогеназ та ацетил-КоА гідролази.
 
УДК 577.15:63
 В.П. ФИЛИМОНЕНКО, П.А .КАЛИМАН
 ВЛИЯНИЕ L-АРГИНИНА НА СОДЕРЖАНИЕ ТБК-РЕАГИРУЮЩИХ ПРОДУКТОВ И НИТРИТОВ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ РАБДОМИОЛИЗЕ В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ ГЕМОКСИГЕНАЗной активности
Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина, Харьков Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Рабдомиолиз - разрушение мышц, массивный выход миоглобина и накопление гема в крови - сопровождается усилением свободнорадикальных процессов в крови и почках. Индукция в почках ключевого фермента деградации гема – гемоксигеназы (ГО), оказывает защитное действие. Ткани сосудов, сердца и лёгких недостаточно изучены при рабдомиолизе. Оксид азота обладает антиоксидантными свойствами и способен регулировать активность ГО. Целью работы явилось исследование содержания ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) и нитритов в сыворотке крови, сосудах, сердце и лёгких крыс при глицерольной модели рабдомиолиза на фоне предварительного введения (за 0,5 ч до глицерола) предшественника NO - L-аргинина, и ингибитора ГО – Zn-протопофирина IX (Zn-PP). Показатели определялись спектрофотометрически через сутки после воздействия.

Введение глицерола (1мл/100г массы тела, в/м) вызывает повышение гемсодержащих продуктов в сыворотке, что сопровождается накоплением ТБК-РП. В сосудах и сердце также увеличивается уровень ТБК-РП, а в лёгких данный показатель не отличается от контроля. Ранее нами установлено, что в лёгких накопление ТБК-РП наблюдается в первые часы рабдомиолиза. Активация свободнорадикальных процессов связана с поступлением гема из сыворотки в ткани. В сосудах при этом отмечается снижение содержания нитритов – стабильных метаболитов NO. В сыворотке и сердце введение глицерола не влияет на содержание нитритов, а в лёгких – вызывает повышение этого показателя.

Предварительное введение L-аргинина (600мг/100г массы тела, в/б) не влияет на повышение содержания ТБК-РП в сосудах, однако в сердце полностью предотвращает увеличение данного показателя.

Введение Zn-PP (2мг/100г массы тела, п/к) предотвращает антиоксидантный эффект L-аргинина в сердце. Более того, ингибирование гемоксигеназ усиливает повышение уровня ТБК-РП в сердце и увеличивает содержания данных веществ в лёгких. В сосудах уровень ТБК-РП при введении Zn-PP остается повышенным, однако содержание нитритов более выражено. Защитное действие ГО обусловлено не только разрушением гема, но и образованием антиоксиданта билирубина и биологически активных моноксида углерода и ионов железа. Ранее нами показано, что при совместном введении L-аргинина и глицерола гемоксигеназная активность повышается в исследованных тканях уже в первые часы после воздействия.

Таким образом, при глицерольной модели рабдомиолиза происходит активация свободнорадикальных процессов в сыворотке, сосудах, сердце и легких крыс. Предварительное введение L-аргинина предотвращает накопление ТБК-РП в сердце, а введение Zn-PP снимает защитный эффект L-аргинина в сердце и приводит к увеличению уровня ТБК-РП в лёгких. Полученные данные свидетельствуют, что антиоксидантный эффект L-аргинина опосредован более ранней индукцией гемоксигеназы.
 
УДК 577.27
А.І.ФЛЯК1, М.В.ЦАПЕНКО2, М.В.ПАВЛОВА2, Ю.М.ГІЛЬЧУК2, П.В.ГІЛЬЧУК2
СТВОРЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИХ ІМУНОКОН’ЮГАТІВ НА ОСНОВІ Fv-ФРАГМЕНТА АНТИТІЛ ТА ЛУЖНОЇ ФОСФАТАЗИ
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України, Київ
  Специфічні моноклональні антитіла, кон’юговані з пероксидазою і фосфатазою, широко використовуються в медичній та лабораторній практиці для детекції цільових антигенів. Кон’югацію антитіл з ферментом традиційно здійснюють хімічним шляхом, що вимагає наявності відносно великої кількості очищених антитіл, певних хімічних реагентів, очищеного ферменту і контрольованих умов його приєднання. Складність процедури одержання моноклональних антитіл (mAbs) обраної специфічності і наявність етапу хімічного приєднання ферменту зумовлює високу вартість створених імунокон’югатів. Сучасні технології клонування ДНК дозволяють створювати генно-інженерні аналоги mAbs і проводити їхню химерізацію з іншими білками-партнерами на рівні послідовностей ДНК. У подальшому, такі химерні білки можуть бути синтезовані в бактеріях з використанням стандартних схем ферментації та недорогих поживних середовищ. Вважаючи на це, привабливою альтернативою існуючому способу одержання імунохімічних зондів на основі mAbs є створення генно-інженерних кон’югатів шляхом химерізації рекомбінантних фрагментів антитіл з  білками, які проявляють ферментативну активність. Одним з найбільш перспективних партнерів для химерізації  є лужна фосфатаза (ЛФ). Існує велика кількість комерційно доступних калориметричних, флуоресцених і хемілюмінесцентних субстратів для ЛФ, що дозволяє використовувати різні схеми детекції  цільового антигену та забезпечує високу чутливість імунохімічного аналізу.

Метою роботи було створення генно-інженерних кон’югатів на основі бактеріальної ЛФ (БЛФ) з покращеною ферментативною активністю і одноланцюгових антитіл миші (ScFv) проти декількох обраних антигенів, а також дослідження можливості використання одержаних імунокон’югатів для детектування цільових антигенів in vitro. У роботі використано наступні методи: мікробіологічні (культивування і трансформація E. coli), генно-інженерні (конструювання рекомбінантних ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, секвенування ДНК), імунохімічні (ELISA, імуноблотинг, імуноцитохімія), біохімічні (електрофорез білків, визначення ферментативної активності), мікроскопія.

Проведено мутагенез БЛФ в результаті якого отримано фермент з підвищеною каталітичною активністю. Проведено дизайн молекул химерних білків та створено плазмідні вектори для їхньої експресії в E. coli. Досліджено і оптимізовано експресію рекомбінантних білків бактеріями. Показано наявність функціональної активності для обох білків-партнерів створених генно-інженерних кон’югатів ScFv-БЛФ, а також можливість практичного їх застосування для детектування цільових антигенів методами ELISA, імуноблотингу та імуноцитохімії.     
  .
УДК: 577.217:577.112.7
P.V. Futernyk, B.S. Negrutskii, and G.V. El’ska
  Interaction of DIFFERENT Mammalian tRNAs with Translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes
Institute of Molecular Biology and Genetics NAS, Kyiv
Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
The translation elongation factor 1A (eEF1A) binds aminoacyl-tRNAs and delivers it to the A-site of the 80S ribosomes. Nowadays, eEF1A*GDP is also suggested to assist tRNA channeling via non-canonical eEF1A*GDP*tRNA complex formation. According to the hypothesis, eEF1A*GDP sequesters deacylated tRNA and delivers it to aminoacyl-tRNA synthetase for re-charging thus completing a cycle of eEF1A-assisted tRNA transport in translation process.

We used fluorescence techniques to characterize the complexes of eEF1A of different origin (yeast eEF1A, rabbit eEF1A1(liver) and eEF1A2 (muscles), GDP and deacylated tRNA3Lys. 1,5-IAEDANS was bound to thiocytidine introduced at position 75 of the tRNA molecule. According to model of eEF1A-tRNA interaction based on the X-ray structure of the eEF1A complex with truncated eEF1B?, it is possible to conclude that the only Trp78 residue of eEF1A could be close enough to perform effective energy transfer to a nucleotide in position 75. Near similar (~ 50%) FRET efficiencies were observed for the yeast eEF1A*GDP*tRNA and rabbit eEF1A1*GDP*tRNA complexes.  The F?rster’s distance ~22 ? was calculated between Trp78 of eEF1A and 1,5-IAEDANS of tRNA. Importantly, the decreased energy transfer efficiency (~35%) was found for eEF1A2*GDP*tRNA complex. F?rster’s distance 24 ? was obtained in that case. That finding might reflect the difference of spatial structures of eEF1A2 and eEF1A1 found by us earlier.

Also, the ability of eEF1A*GDP from different sources to bind deacylated [32P]-labeled tRNAs of various specificities was analyzed with gel shift assay. The ability of tRNAVal, tRNATyr, tRNALys, tRNAiMet from rabbit liver and tRNAfMet from E.coli to interact with yeast/rabbit eEF1A was examined. In accordance with literature data, no interaction of E.coli EF1A  with cognate tRNAfMet or  tRNALeu from T.thermophilus was observed. However, apparent Kds values for the ternary complexes of rabbit eEF1A1*GDP and elongator tRNAs evidenced the interaction. There were in the range between 0.5 and 1 mkM for the eEF1A1 and typically two-fold higher for the analogous eEF1A2 complexes. Difference in tRNA binding affinity of the eEF1A1 and eEF1A2 along with possible configuration differences of the ternary complexes suggested by fluorescence measurements may be indicative of certain alterations in the tRNA CCA-terminus binding sites of the eEF1A isoforms. The complexes of yeast eEF1A*GDP and various tRNAs were also detected, with apparent Kds in the range 0.1 – 0.25 mkM.

Surprisingly, rabbit and E.coli initiator deacylated tRNAs were able to bind both yeast and rabbit eEF1A with relatively high affinity. We explain this observation by the absence of the crucial antideterminants for eEF1A binding in vertebrate and E.coli deacylated tRNAiMet which correlates with literature data. Thus, eEF1A can bind initiator tRNA after its participation in translation initiation step, sequester it and deliver to methionyl-tRNA synthetase for re-charging.
 
УДК 579.69 + 577.112
М.В.ЦАПЕНКО1, А.І.ФЛЯК1, О.Б.ГОРБАТЮК2, Ю.М.ГІЛЬЧУК2, П.В.ГІЛЬЧУК2
СТВОРЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИХ ІМУНОКОН’ЮГАТІВ НА ОСНОВІ Fv-ФРАГМЕНТА АНТИТІЛ ТА ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ БІЛКІВ
1Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
Специфічні моноклональні антитіла, кон‘юговані з флуоресцентними мітками, є цінними імунологічними реагентами, які широко використовуються в медичній та лабораторній практиці для візуалізації асоційованих з клітинами антигенів. Кон‘югацію антитіл з флуоресцентними мітками традиційно здійснюють хімічним шляхом, що вимагає наявності відносно великої кількості очищених антитіл, хімічно активованої флуоресцентної мітки і контрольованих умов її приєднання для запобігання втрати антигензв’язувальної активності продукту. Складність процедури одержання моноклональних антитіл обраної специфічності і наявність етапу хімічного приєднання мітки зумовлює високу вартість одержаних імунофлуоресцентних зондів. Сучасні технології клонування ДНК дозволяють створювати генно-інженерні аналоги моноклональних антитіл і проводити їхню химерізацію з іншими білками-партнерами на рівні послідовностей ДНК. У подальшому такі химерні білки можуть бути синтезовані в бактеріях з використанням стандартних схем ферментації та недорогих поживних середовищ. Зважаючи на це, привабливою альтернативою існуючому способу одержання флуоресцентних кон‘югатів моноклональних антитіл є створення генно-інженерних кон’югатів шляхом химерізації рекомбінантних фрагментів антитіл з  флуоресцентними білками.  

Метою роботи було створення генно-інженерних імунокон’югатів на основі специфічних до IFN-?2b людини одноланцюгових антитіл (ScFv) і флуоресцентних білків (ФБ), а також дослідження можливості використання одержаних флуоресцентних зондів (ScFv-ФБ) у процедурах детектування цільового антигену in vitro. У роботі використано наступні методи: мікробіологічні (культивування і трансформація E. coli), генно-інженерні (конструювання рекомбінантних ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, електрофорез ДНК, секвенування ДНК), імунохімічні (ELISA, імуноблотинг), біохімічні (виділення і хроматографічне очищення білків, електрофорез білків), флуоресцентна мікроскопія. 

Проведено дизайн молекул рекомбінантних білків та створено плазмідні вектори для експресії ScFv-ФБ у бактеріях E. coli. Партнерами для злиття було обрано білки EGFP та mCherry, які випромінюють, відповідно, у зеленій (508 нм) та червоній (610 нм) областях спектру і мають високі показники яскравості та стабільності. Досліджено експресію створених химерних білків ScFv-ФБ клітинами E. coli у разі використання різних промоторів та стратегій біосинтезу. Запропоновано спосіб суперпродукції ScFv-ФБ в E. coli та їхнього виділення в очищеному та розчинному стані. Імунохімічними та імунофлуоресцентними методами показано збереження функціональної активності обох білків-партнерів створених генно-інженерних зондів та перспективність їхнього використання для імунофлуоресцентного аналізу.
 
УДК 577.151.6
В.О.Чернишенко
Нова ?-Фібриногеназа, як інструмент вивчення системи гемостазу
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
  Протеолітичні ферменти знайшли широке застосування у фундаментальних дослідженнях структурно-функціональних особливостей білків, а також у медичних технологіях (Beynon, 2001).

Одним з перспективних напрямків є використання протеїназ у технології обмеженого протеолізу. Дана технологія дозволяє верифікувати результати рентгеноструктурного аналізу та молекулярного моделювання, пов’язавши їх з функціональними особливостями досліджуваних білків (Fontana, 2004). Перспективним є вивчення функціональних особливостей фібриногену з використанням фібриногеназ.

Фібриногенази також є перспективними для запобігання гіперфібриногенемії – швидкого та безпечного зниження рівню фібриногену в кровотоці за рахунок прямої протеолітичної дії (Gardiner, 2008).

Раніше нами було описано  нову фібриногеназу в складі отрути Echis multisquamatis (Chernyshenko, 2008). Метою роботи була характеристика даної фібриногенази та оцінка її придатності до застосування у вивченні системи гемостазу.

Розроблено метод двостадійного хроматографічного очищення електрофоретично гомогенного препарату фібриногенази, визначено молекулярну масу (35±1 кДа) та амінокислотний склад ферменту. Показано та охарактеризовано аргінін-естеразну та аргінін-амідазну активність фібриногенази. За результатами інгібіторного аналізу визначено її належність до класу серинових протеїназ.

Протеолітична дія досліджуваної фібриногенази спрямована на N-кінцеву ділянку B?-ланцюга молекули фібриногену. Визначено пептид, відщеплюваний даним ферментом на першвій стадії фібриногенолізу (3,3±0,2 кДа), що дозволило припустити її вірогідну мішень: пептидний зв’язок B?Arg23-Glu24. У програмі Totallab ХL100 за даними електрофореграм обчислено константу Міхаеліса процесу первинного гідролізу B?-ланцюга молекули фібриногену: 8,3 ?M. Методом обмеженого протеолізу отримано стабільні препарати дезB?(1-23)-фібриногену та дезААдезB?(15-23)-фібрину, показано їх функціональну відмінність від нативного фібриногену та фібрину відповідно.

Описана фібриногеназа не має фібринолітичної, геморагічної та гемолітичної активності. Не виявлено впливу фібриногенази на інші білки системи зсідання крові: протромбін, плазміноген та протеїн С. Показана здатність фібриногенази розщеплювати згусток, утворений дезАА-фібрином. Показано, що 2,5-хвилинна експозиція фібриногену з фібриногенеазою (100:1) призводить до зниження швидкості тромбін-індукованої полімеризації на 30%.

Таким чином, охарактеризовано нову ?-фібриногеназу; досліджено її дію на фібриноген; отримано продукти обмеженого фібриногенолізу, придатні для використання у in vitro та in vivo дослідженнях. Показано, що дана фібриногеназа володіє специфічною дією на фібриноген та не має побічних ефектів, описаних для інших ферментів зміїних отрут, що дозволяє сподіватися на можливість його застосування як клінічного дефібриногенувального агента.

УДК 616.36-008.9-02:616.37-002-036.11-085.224]-092.9
О.З. ЯРЕМЧУК
ЗМІНИ ДЕЯКИХ ОКИСЛЮВАЛЬНИХ ПРОЦЕСІВ У ПЕЧІНЦІ ПРИ ГОСТРОМУ ПАНКРЕАТИТІ ТА ЗАСТОСУВАННІ L-АРГІНІНУ
  Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського, м. Тернопіль, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
 
Мета дослідження – встановлення впливу донатора синтезу оксиду азоту L-аргініну на  стан системи прооксиданти-антиоксиданти та показники енергозабезпечувальних процесів мітохондрій печінки при гострому експериментальному панкреатиті. Піддослідних тварин розділили на 3 групи: 1 – несправжньо оперовані тварини; 2 – тварини з гострим панкреатитом (ГП), який моделювали за методом С.О. Шалімова — шляхом локального заморожування обох поверхонь підшлункової залози хлоретилом; 3 – тварини, яким вводили щоденно протягом 7 днів перед та одноразово через 12 год після моделювання ГП, внутрішньоочеревинно L-аргініну гідрохлорид (L-аргінін) (“Sigma”, США, 25 мг/кг маси тварини). Біохімічні дослідження проводили через 7 діб після моделювання патології.

Встановлено, що при ГП у сироватці крові спостерігалось підвищення активності ?-амілази у 9,5 раза та концентрації сечовини на 41 %, порівняно з групою контрольних тварин. Зростав вміст стабільного метаболіту оксиду азоту NO2– у печінці на 62 %, що ймовірно свідчило про активацію індуцибельної NO-синтази при ГП. Одночасно у гомогенатах печінки відбувалось зниження активності супероксиддисмутази (СОД) на 68 %, каталази (КАТ) на 51 % та вмісту відновленого глутатіону (G-SH) на 61 %. Відмічено зростання активності процесів переокислення мембранних ліпідів: вміст гідроперекисей ліпідів (ГПЛ) та ТБК-активних продуктів (ТБП) збільшувався відповідно на 143 % та 141 %. Виявлено порушення функціонування електроннотранспортного ланцюга мітохондрій, про що свідчило зменшення активності цитохромоксидази (ЦХО) на 37 % і сукцинатдегідрогенази (СДГ) на 50 %.

На тлі застосування L-аргініну встановлено подальше зростання активності ?-амілази, концентрації сечовини у сироватці крові та рівня синтезу NO2– у печінці на 59, 8 та 18 % відповідно, порівняно з контрольною патологією. Одночасно спостерігалось достовірне зниження активності КАТ та вмісту G-SH на 14 та 13 % відповідно, та мітохондріальних ферментів — ЦХО та СДГ на 10 та 13 % відповідно. Зростав вміст ГПЛ та ТБП на 14 % та 11 % відповідно.

Отже, на підставі проведених досліджень можна стверджувати, що у розвитку ураження печінки при гострому експериментальному панкреатиті відіграє важливу роль активація системи L-аргінін-оксид азоту. Це підтверджується зростанням синтезу NO у печінці при ГП та прогресуванням патологічних змін у цьому органі на тлі застосування попередника синтезу оксиду азоту L-аргініну.
 
Інформаційний лист №2
  Вельмишановні колеги!
  Маємо честь повідомити, що 28-29 травня 2009 року у приміщенні конференційної зали Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9; І корпус Інституту, ІІІ поверх) відбудеться Конференція молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології–2009”. Порядок денний, список учасників та програма Конференції додаються.
 
Тривалість доповіді не повинна перевищувати 10 хвилин, а відповідей на запитання – 5 хвилин. Мова доповіді – українська, російська або англійська. Порядок виступів учасників конференції в межах кожного пленарного засідання буде визначатись жеребкуванням. Серед технічних засобів у розпорядженні доповідачів будуть мікрофон, лазерна указка, а також проектор для показу прозорих плівок та комп’ютер з проектором для демонстрації презентацій у “Power Point”. Якщо буде підготовлено презентацію у “Power Point”, бажано надіслати його заздалегідь або принести файл з презентацією на дискеті чи компакт-диску за день до конкурсу (11 червня) у кімн. 25  I-го корпусу Інституту біохімії.
  З метою всебічної та об’єктивної оцінки представлених на Конкурс робіт буде сформовано Конкурсну комісію у такому складі:
 1.     Комісаренко С.В., акад. НАН та АМН України, директор Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Голова Конкурсної комісії;
2.     Мінченко О.Г., д.б.н., заступник директора Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України з наукової роботи, заст. Голови Конкурсної комісії;
3.     Колибо Д.В., к.б.н., заступник директора Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України з наукової роботи;
4.     Коваль Л.М., к.б.н.,  Голова Ради молодих учених Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
5.     Гула Н.М., член-кореспондент НАН та АМН України, зав. відділом, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
6.     Кудінов С.О., професор, д.б.н., зав. відділом, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
7.     Виноградова Р.П., професор, д.б.н., пров. наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
8.     Пархоменко Ю.М., д.б.н., пров. наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
9.     Малюта С.С., член-кореспондент НАН України, зав. відділом, Інститут молекулярної біології і генетики – (за згодою);
10.    Корнелюк О.І., член-кореспондент НАН України, зав. відділом, Інститут молекулярної біології і генетики – (за згодою);
11.    Матишевська О.П., професор кафедри біохімії, Київський національний університет імені Тараса Шевченка – (за згодою);
12.    Літошенко О.Я., д.б.н., зав. відділом, Інститут геронтології АМН України – (за згодою);
13.    Микоша О.С., професор, д.м.н., Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України – (за згодою);
14.    Великий М.М., професор, д.б.н., пров. наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
15.    Дмитренко М.П., професор, д.б.н., зав. відділом, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
16.    Дробот Л.Б., професор, д.б.н., зав. лабораторією, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
17.    Гіммельрейх Н.Г., к.б.н., зав. відділом, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
18.    Векліч Т.О., к.б.н., наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
19.    Гриценко П.Г. к.б.н., наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України;
20.    Борисова Т.О., к.б.н., ст. наук. співробітник, Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України - секретар комісії.
 
Конкурсна комісія при оцінці робіт учасників Конференції-конкурсу звертатиме особливу увагу, перш за все, на актуальність піднятої проблеми, адекватність обраних методичних прийомів експерименту, відповідність висновків поставленій меті та отриманим результатам, вміння подати матеріал та вільне володіння ним, аргументованість та вичерпність відповідей на запитання. Переможці конференції-конкурсу визначаються за середнім балом після автоматичної обробки бюлетенів конкурсної комісії.
 
Переможцям конкурсу буде вручено дипломи та грошові премії:
I  місце – 1250 гривень,
II місце – 1000 гривень,
III місце – 750 гривень.
Кількість премій буде визначена остаточно в залежності від якості доповідей, представлених на конкурс. Премії оподатковуються.
  Матеріали Конференції будуть опубліковані у вигляді тез доповідей в одному з найближчих номерів “Українського біохімічного журналу” під відповідною рубрикою.
 

Нагадуємо наші реквізити:

01030, Київ, вул. Леонтовича, 9; телефон – 234-33-54; електронна пошта: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. або Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. (Людмила Миколаївна Коваль – Голова Ради молодих учених). Будь ласка, консультуйтеся з нами у разі виникнення якихось запитань або проблем.
 
Додатки:   1. Порядок денний Конференції молодих учених
                  2. Список учасників
                  3. Програма Конференції
          
З найкращими побажаннями
Голова Ради молодих учених
Інституту біохімії к.б.н. Коваль Л.М.
 

Додаток 1
Порядок денний Конференції молодих учених
 28 травня (четвер)
  9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – Вступне слово академіка С.В.Комісаренка
10.15 – І пленарне засідання
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІІ пленарне засідання
17.00 – Завершення роботи першого дня конференції
 
29 травня (п`ятниця) 
  9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – ІІІ пленарне засідання
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІV пленарне засідання
16.00 – Підведення підсумків, нагородження переможців і закриття конференції.
 
 Додаток 2
  Список учасників
1.                 Анісімов Володимир Юрійович (Одеський державний медичний університет)Активність препаратів Na+, K+-АТФази виділених з мозку та нирок щурів після введення комплексу вітамінів групи В.
2.                 Асмолкова Валентина Сергіївна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ)Вплив N-ацилетаноламінів на показники життєздатності та процес диференціації  міогенних клітин in vitro.
3.                 Басараба Ольга Іванівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Stady of RUK/CIN85 functional role in human cervical adenocarcinoma.
4.                 Бевза Альона Анатоліївна (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ) Вивчення впливу  каліксаренів С-99 та С-107 на активність АТР-ази актоміозину та субфрагменту-1 міозину.
5.                 Верем’єва Марина Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Експресія ізоформ а1 і а2 фактора елонгації трансляції eEF1 при раку шлунку людини.
6.                 Горбатюк Оксана Борисівна (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Оптимізація очищення і ренатурації рекомбінантних білків із тілець включення E. coli з використанням металафінної хроматографії.
7.                 Горюшкіна Татьяна Борисівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Дослідження ефективності застосування лактат оксидази та флавоцитохрому  b2 при розробці амперометричного  біосенсора для аналізу  лактату у вині.
8.                 Гриджук Олеся Сергіївна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Виділення та ідентифікація молекулярних партнерів білка PTTG.
9.                 Дворщенко Катерина Олександрівна (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Перекисне окиснення ліпідів у мітохондріях слизової оболонки шлунка щурів за умов виразки.
10.             Дворщенко Олег Станіславович (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецкого НАНУ) Протипухлинна активність ембріональних курячих антигенів і фуллерена С60.
11.             Іванов Євген Геннадійович (Інститут проблем кріобіологіі і кріомедицини НАН України) Стимуляция метаболизма в хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови.
12.             Калинкевич Оксана Владимировна (Институт прикладной физики НАНУ) Биохимическое обоснование применения композитных материалов на основе хитозана и фосфатов кальция для замещения костных дефектов.
13.            Канюка Олена Петрівна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Knockout off PTTG-1 leads to impaired haemopoesis and disruption of macrophage-induced elimination of apoptotic cells and old erytrocytes in mice.
14.            Климишин Дмитро Олександрович (Львівський національний університет імені Івана Франка) Конструювання плазміни pKC1139snorA::aadA для спрямованої інактивації гена snorA, імовірного активатора транскрипції генів біосинтезу ногаламіцину у  Streptomyces nogalater.
15.             Ковалик Леся Іванівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Investigation of Lys methylation of eEF1A1 in normal and tumor cells by the mass-spectroscopic analysis.
16.             Курліщук Юлія Валеріївна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Вплив голодування за рядом незамінних амінокислот та клітини пухлин людини різного тканинного походження.
17.             Ларіонов Віталій Борисович (Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАНУ) Розробка та впровадження  методів ферментативної кінетики метаболізму лікарських засобів.
18.             Литвиненко Ірина Ігорівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Прискорення фібринолізу в присутності протеїну С.
19.             Людковська Владислава Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Реконструкція in vitro комплексу eEF1B??g, що входить до складу важкої форми фактора елонгації трансляції.
20.             Марунич Ростислав Юрійович (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Вплив доменант-негативної конструкції 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-3 та -4 на експресію природних ізоформ цього ферменту.
21.             Наумова Наталія Вадимівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Акумуляція іонів Са у деполяризованих мітохондріях міометрія.
22.             Новосильна Олександра Валеріївна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Дослідження характеру адсорбції ізоформ фактора елонгації трансляції 1A ссавців на поверхні з різною енергетикою.
23.             Новохацька Тетяна Василівна (Національний університет «Києво-Могилянська Академія») The expression of eukaryotic elongation factor 1 B (eEF1B) in human gastric carcinoma.
24.             Олійник Олена Сергіївна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір  одноланцюгових scFv -антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину.
25.             Павлик Юлія Ярославівна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Pretreatment of cancer cells with low doses of  transforming growth factor-B1 can enhance antitumor effect of doxorubicin.
26.             Редчук Тарас Анатолійович (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Клонування, експресія, очистка та антигенні властивості злитого білка, що містить послідовності антигенів MPT63 ТА MPT83 Mycobacterium tuberculosis.
27.             Руденко Ярослав Олександрович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Структурно-функціональний стан різних фракцій клітин СОШ при виразко утворенні.
28.             Сівко Роман Віталійович (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Plasma membrane cholesterol depletion directly affects the function of synaptic vesicles, thereby altering the release and uptake of glutamate by isolated nerve terminals.
29.             Скалдін Максим Володимирович (Херсонський державний університет) Изучение взаимодействия EphB2 рецептора с эфрином-B2 в растворе.
30.             Слончак Андрій Миколайович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Клітинно-специфічні особливості регуляції транскрипції гена глутатіон S-трансферази Р1 людини.
31.             Терлецький Богдан Миронович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка; Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Нові підходи до контролю якості імунотропних препаратів на основі інтерферону альфа та гамма.
32.             Федосюк Софія Петрівна (Інститут біології клітини НАНУ) Конструювання штамів неконвенційних дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis з делецією сукцинатдегідрогенази з метою покращення синтезу етанолу та дослідження їхніх біохімічний характеристик.
33.             Филимоненко Вікторія Павловна (Харківский національний університет ім. В.Н. Каразіна) Влияние L-аргинина на содержание ТБК-реагирующих продуктов и нитритов в тканях крыс при рабдомиолизе в условиях ингибирования гемоксигеназной активности.
34.             Фляк Андрій Ігорович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Cтворення та характеристика генно-інженерних імунокон’югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та лужної фосфатази.
35.             Футерник Павло Володимирович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Interaction of different mammalian tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes.
36.             Цапенко Марина Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Створення та характеристика генно-інженерних імунокон?югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та флуоресцентних білків.
37.             Чернишенко Володимир Олександрович (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Нова B?-фібриногеназа, як інструмент дослідження системи гемостазу.
38.             Яремчук Ольга Зеновіївна (Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського) Зміни деяких окислювальних процесів у печінці при гострому панкреатиті та застосуванні L-аргініну.
  
Додаток 3
Програма Конференції
І пленарне засідання
28травня 10.15 – 13.00
  1.     Анісімов Володимир Юрійович (Одеський державний медичний університет)Активність препаратів Na+, K+-АТФази виділених з мозку та нирок щурів після введення комплексу вітамінів групи В.
2.     Асмолкова Валентина Сергіївна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ)Вплив N-ацилетаноламінів на показники життєздатності та процес диференціації  міогенних клітин in vitro.
3.     Басараба Ольга Іванівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Stady of RUK/CIN85 functional role in human cervical adenocarcinoma.
4.     Бевза Альона Анатоліївна (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ) Вивчення впливу  каліксаренів С-99 та С-107 на активність АТР-ази актоміозину та субфрагменту-1 міозину.
5.     Верем’єва Марина Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Експресія ізоформ а1 і а2 фактора елонгації трансляції eEF1 при раку шлунку людини.
6.     Горбатюк Оксана Борисівна (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Оптимізація очищення і ренатурації рекомбінантних білків із тілець включення E. coli з використанням металафінної хроматографії.
7.     Горюшкіна Татьяна Борисівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Дослідження ефективності застосування лактат оксидази та флавоцитохрому  b2 при розробці амперометричного  біосенсора для аналізу  лактату у вині.
8.     Гриджук Олеся Сергіївна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Виділення та ідентифікація молекулярних партнерів білка PTTG.
9.     Дворщенко Катерина Олександрівна (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Перекисне окиснення ліпідів у мітохондріях слизової оболонки шлунка щурів за умов виразки.
10. Дворщенко Олег Станіславович (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецкого НАНУ) Протипухлинна активність ембріональних курячих антигенів і фуллерена С60.
  ІІ пленарне засідання

28 травня 14.00 – 17.00
1.     Іванов Євген Геннадійович (Інститут проблем кріобіологіі і кріомедицини НАН України) Стимуляция метаболизма в хрящевой ткани после механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови.
2.     Калинкевич Оксана Владимировна (Институт прикладной физики НАНУ) Биохимическое обоснование применения композитных материалов на основе хитозана и фосфатов кальция для замещения костных дефектов.
3.     Канюка Олена Петрівна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Knockout off PTTG-1 leads to impaired haemopoesis and disruption of macrophage-induced elimination of apoptotic cells and old erytrocytes in mice.
4.     Климишин Дмитро Олександрович (Львівський національний університет імені Івана Франка) Конструювання плазміни pKC1139snorA::aadA для спрямованої інактивації гена snorA, імовірного активатора транскрипції генів біосинтезу ногаламіцину у  Streptomyces nogalater.
5.     Ковалик Леся Іванівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Investigation of Lys methylation of eEF1A1 in normal and tumor cells by the mass-spectroscopic analysis.
6.     Курліщук Юлія Валеріївна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Вплив голодування за рядом незамінних амінокислот та клітини пухлин людини різного тканинного походження.
7.     Ларіонов Віталій Борисович (Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАНУ) Розробка та впровадження  методів ферментативної кінетики метаболізму лікарських засобів.
8.     Литвиненко Ірина Ігорівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Прискорення фібринолізу в присутності протеїну С.
9.     Людковська Владислава Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Реконструкція in vitro комплексу eEF1B??g, що входить до складу важкої форми фактора елонгації трансляції.
10. Марунич Ростислав Юрійович (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Вплив доменант-негативної конструкції 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-3 та -4 на експресію природних ізоформ цього ферменту.
 

ІІІ пленарне засідання
29 травня 10.00 – 13.00

1.     Наумова Наталія Вадимівна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Акумуляція іонів Са у деполяризованих мітохондріях міометрія.
2.     Новосильна Олександра Валеріївна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Дослідження характеру адсорбції ізоформ фактора елонгації трансляції 1A ссавців на поверхні з різною енергетикою.
3.     Новохацька Тетяна Василівна (Національний університет «Києво-Могилянська Академія») The expression of eukaryotic elongation factor 1 B (eEF1B) in human gastric carcinoma.
4.     Олійник Олена Сергіївна (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових scFv -антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину.
5.     Павлик Юлія Ярославівна (Львівський національний університет імені Івана Франка; Інститут біології клітини НАНУ) Pretreatment of cancer cells with low doses of  transforming growth factor-B1 can enhance antitumor effect of doxorubicin.
6.     Редчук Тарас Анатолійович (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Клонування, експресія, очистка та антигенні властивості злитого білка, що містить послідовності антигенів MPT63 ТА MPT83 Mycobacterium tuberculosis.
7.     Руденко Ярослав Олександрович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Структурно-функціональний стан різних фракцій клітин СОШ при виразко утворенні.
8.     Сівко Роман Віталійович (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Plasma membrane cholesterol depletion directly affects the function of synaptic vesicles, thereby altering the release and uptake of glutamate by isolated nerve terminals.
9.     Скалдін Максим Володимирович (Херсонський державний університет) Изучение взаимодействия EphB2 рецептора с эфрином-B2 в растворе.
10. Слончак Андрій Миколайович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Клітинно-специфічні особливості регуляції транскрипції гена глутатіон S-трансферази Р1 людини.
 
ІV пленарне засідання
29 травня 14.00 – 16.00

1.     Терлецький Богдан Миронович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка; Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ) Нові підходи до контролю якості імунотропних препаратів на основі інтерферону альфа та гамма.
2.     Федосюк Софія Петрівна (Інститут біології клітини НАНУ) Конструювання штамів неконвенційних дріжджів Hansenula polymorpha та Pichia stipitis з делецією сукцинатдегідрогенази з метою покращення синтезу етанолу та дослідження їхніх біохімічний характеристик.
3.     Филимоненко Вікторія Павловна (Харківский національний університет ім. В.Н. Каразіна) Влияние L-аргинина на содержание ТБК-реагирующих продуктов и нитритов в тканях крыс при рабдомиолизе в условиях ингибирования гемоксигеназной активности.
4.     Фляк Андрій Ігорович (Київський національний університет імені Тараса Шевченка) Cтворення та характеристика генно-інженерних імунокон’югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та лужної фосфатази.
5.     Футерник Павло Володимирович (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Interaction of different mammalian tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes.
6.     Цапенко Марина Вікторівна (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ) Створення та характеристика генно-інженерних імунокон?югатів на основі Fv-фрагмента антитіл та флуоресцентних білків.
7.     Чернишенко Володимир Олександрович (Інститут біохімії ім. О.В Палладіна НАНУ) Нова B?-фібриногеназа, як інструмент дослідження системи гемостазу.
8.     Яремчук Ольга Зеновіївна (Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського) Зміни деяких окислювальних процесів у печінці при гострому панкреатиті та застосуванні L-аргініну.
Інформаційний лист №1
Вельмишановні колеги!
Дирекція Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України спільно з Радою молодих
учених (РМУ) планують у травні-червні 2009 року провести наукову конференцію молодих
учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2009”.
В рамках конференції планується провести конкурс робіт молодих науковців, які працюють
у галузі фундаментальної та прикладної біохімії, а також біотехнології. Переможці конкурсу
(1–3 місця) будуть нагороджені преміями. Доповідачі, які не посіли призового місця,
але продемонстрували високий науковий рівень, будуть також відзначені.

Умови участі в конкурсі.
1. Вік конкурсантів – до 35 років включно.
2. На конкурс не можуть бути представлені роботи, які раніше брали участь в цьому конкурсі
або подібних конкурсах в Україні, але можуть бути представлені оригінальні власні
дослідження, що раніше частково були опубліковані в наукових журналах.
3. Для участі у конкурсі необхідно українською, російською чи англійською мовами
заповнити реєстраційну картку (card.doc) та надіслати електронною поштою разом з
тезами доповіді на адресу Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. Правила оформлення тез доповіді
представлено у файлі (tezi.doc).
4. Тези доповідей учасників конференції будуть опубліковані в Українському біохімічному
журналі та розміщені на сайті нашого Інституту.
5. У випадку відсутності доступу до ресурсів Інтернет необхідно надіслати поштою на
адресу РМУ (к.б.н. Людмилі Коваль, Рада молодих учених, Інститут біохімії НАН України,
вул. Леонтовича 9, м. Київ 01030, Україна) тези доповіді на 1 сторінку в форматі Microsoft
Word і реєстраційну картку з відомостями про доповідача (прізвище, ім’я, по-батькові; рік
народження; місце навчання або роботи, поштова адреса місця навчання або роботи; посада,
науковий ступінь (якщо є); контактний телефон, факс, e-mail; тема доповіді, УДК тези
доповіді).
6. Заповнену реєстраційну форму та тези доповіді необхідно надіслати до РМУ не пізніше
20 квітня 2009 року.
7. Радою молодих учених буде проведений попередній відбір конкурсантів на підставі
рецензування тез. Учасники конференції до 10 травня 2009 року будуть проінформовані про
точну дату і деталі проведення конференції-конкурсу.
З подальшою інформацією про хід підготовки до конференції можна буде ознайомитися на
сайті нашого Інституту www.biochemistry.org.ua у розділі Рада молодих учених.
Якщо у Вас виникнуть питання чи пропозиції, звертайтесь, будь ласка, до Голови Ради
молодих учених – Людмили Коваль (тел.: 234-33-54; e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.) або
секретаря Ради – Даші Корольової (тел.: 235-51-72; e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.).

З побажаннями доброго співробітництва,
Голова Ради молодих учених
канд. біол. наук Л.М. Коваль

Правила оформлення тез доповіді

• Тези доповіді мають бути подані у форматі MS Word обсягом до 350 слів
(не більше 3 тисяч знаків).
• Шрифт Times New Roman, розмір 12, одиничний інтервал між рядками.
• Номер УДК розміщується у верхньому лівому куті звичайним шрифтом.
• Прізвища авторів мають бути надруковані ВЕЛИКИМИ ЛІТЕРАМИ курсивом по
центру сторінки. Доповідач має бути підкресленим.
• Заголовок тез має бути надрукований ВЕЛИКИМИ ЛІТЕРАМИ жирним шрифтом
по центру сторінки.
• Місце роботи або навчання, місто; e-mail адреса доповідача мають бути розміщені
по центру та виділені курсивом.
• У випадку, коли колектив авторів працює у різних установах, адреси мають
подаватись за зразком:
А. Б. ПЕТРОВ1, В. Г. ІВАНОВ2, Д. Е. СИДОРОВ1
1Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ; Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
2Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ
• Бажано, щоб тези доповіді були структуровані, як показано нижче:
1. Введення.
2. Методи.
3. Результати.
4. Висновки.
• Стандартні скорочення можуть бути використані при їхньому розшифруванні за
першого згадування в тексті.
• Таблиці, діаграми та рисунки до тез не подаються.
• Якщо у Вас виникнуть питання чи пропозиції, звертайтесь, будь ласка, до Голови
Ради молодих учених – Людмили Коваль (тел.: 234-33-54; e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.)
або секретаря Ради – Даші Корольової (тел.: 235-51-72; e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.).