Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 15-го вересня 2015 р. (вівторок) о 10-30 у Актовій залі Інституту відбудеться чергове засідання семінару. Будемо слухати доповідь м.н.с. відділу молекулярної імунології ІБХ НАНУ Короткевич Наталії Валеріївни «МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕАЛІЗАЦІЇ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ГЕПАРИН-ЗВ’ЯЗУВАЛЬНОГО EGF-ПОДІБНОГО ФАКТОРУ РОСТУ ЛЮДИНИ». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Як завжди, додаємо до цього листа файл із авторськими тезами доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
З повагою – С.О.Костерін.
МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕАЛІЗАЦІЇ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ГЕПАРИН-ЗВ’ЯЗУВАЛЬНОГО EGF-ПОДІБНОГО ФАКТОРУ РОСТУ ЛЮДИНИ
Короткевич Наталія Валеріївна
м.н.с. відділу молекулярної імунології
Актуальність. Гепарин-зв’язувальний фактор росту, подібний до епідермального ростового фактору – HB-EGF (від англ.: Heparin-Binding Epidermal growth factor-like Growth Factor), належить до родини епідермальних ростових факторів та синтезується у вигляді мембрано-заякореного попередника pro-HB-EGF, що під дією мембарнних протеїназ може переходити в розчинну форму фактору – sHB-EGF (від англ.: soluble HB-EGF). Рецепторами для sHB-EGF є гомодимери рецепторів родини епідермальних ростових факторів першого (HER-1, EGFR, Human Epidermal Growth Factor Receptor) та четвертого типу (HER-4), а також їх гетеродимери із HER-2 та HER-3. Зв’язування sHB-EGF з рецептором призводить до утворення ліганд-рецепторного комплексу sHB-EGF/EGFR і активації сигнальних шляхів, які відіграють вирішальну роль у регулюванні проліферації, диференціації, міграції та інгібуванні апоптозу клітин, що є особливо важливим при злоякісних перетвореннях.
Зазвичай, EGFR реалізує свої функції, що полягають у підтриманні росту та виживання, у мембрано-заякореному стані на поверхні плазматичної мембрани. Однак, дослідження останніх 15 років виявили здатність EGFR проявляти свої функції шляхом внутрішньоклітинної у внутрішньоклітинних органелах, зокрема, у ядрі клітини. Всередині ядра клітини, EGFR може функціонувати в якості ко-транскрипційного фактору регулюючи експресію генів, що беруть участь у прогресуванні пухлинного росту, шляхом фосфорилювання внутрішньоядерних мішеней підвищуючи репаративні процеси у ядрі клітин. Таким чином, функціонування EGFR у ядрі клітини слугує для визначення його участі у канцерогенезі та механізмах трансформації клітин на що вказує зворотній взаємозв’язок між виживанням пацієнті та рівнем експресії рецептора, стійкість пухлин до протипухлинної терапії (опромінення, хіміотрепія, EGFR-направлена терапія з використанням антитіл та специфічних інгібіторів) та посилений пухлинній ріст. Виявлена здатність EGFR транспортуватися до ядра пухлинних клітин вказує на існування двох різних фенотипів пухлин. У першому випадку EGFR знаходиться у мембрано-заякореному стані та впливає на пухлинний ріст шляхом активації проліферативних сигнальних шляхів, у другому – шляхом реалізації біологічної активності у ядрі клітини виступаючи у ролі транскрипційного фактору та/або фосфорилюючи ряд внутрішньоядерних мішеней.
З іншого боку, HB-EGF також може виступати у ролі індуктора пухлинного росту та ангіогенезу. Рівень експресії HB-EGF підвищується при злоякісних пухлинах людини, у тому числі, при гепатоцелюлярному раку шлунку, раку молочної залози, меланоми, раку товстої кишки, раку підшлункової залози, гліобластомі та гліомі. Підвищення рівня експресії HB-EGF у пухлинних клітинах відбувається за рахунок онкогенів v-Ras та/або v-Raf. Зокрема, було виявлено, що індукована експресія онкогену v-Raf у нормальних клітинах призводила до підвищення рівня експресії HB-EGF шляхом аутокринного регулювання Raf/MAPK сигнального шляху. Також було виявлено роль HB-EGF у v-Jun-опосередкованій пухлинній трансформації, де HB-EGF виступає в якості мішені для онкогену v-Jun.
Одним із можливих біологічних значень гіперекспресії НВ-EGF при онкогенезі є його здатність активувати промотор цикліну D, можливо, v-Jun-опосередкованим шляхом. Також, ген HB-EGFє однією із мішеней для р53, що може призводити до підвищення експресії HB-EGF та сприяти виживанню пухлинних клітин шляхом аутокринної активації МАРК та AKT сигнальних шляхів.
Як вже зазначалося, HB-EGF та EGFR входять до складу однієї родини епідермальних ростових факторів та рецепторів та можуть мати функціональний взаємозв’язок при злоякісному перетворенні та стійкості пухлинних клітин. Такий взаємозв’язок може виявлятися не лише у вигляді ліганд-індукованої активації відповідних сигнальних шляхів, що виявляється, переважно, шляхом аутокринної активації, а і у існуванні певних механізмів реалізації біологічної активності HB-EGF та EGFR всередині клітини, зокрема, у вигляді ліганд-рецепторного комплексу.
Таким чином, дослідження механізмів функціонального взаємозв’язку між HB-EGF та EGFR на моделі пухлинних клітин наддасть можливість розуміння комплексної ролі ліганду та рецептору механізмах канцерогенезу. Отримані дані можуть бути використані для розробки та застосування комплексних протипухлинних препаратів спрямованих на пригнічення експресії генів або інгібування біологічної активності як ліганду, так і рецептору.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної активності sHB-EGF людини, зокрема, щодо клітин з надекспресією EGFR.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
- Отримати рекомбінантний аналог sHB-EGF людини.
- Отримати флуоресцентні похідні sHB-EGF шляхом об’єднання нуклеотидних послідовностей sHB-EGF та червоного флуоресцентного протеїну mCherry.
- Отримати генетичні конструкції, що дозволяють проводити дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної активності sHB-EGF на клітинному та організменному рівні.
- Дослідити здатність sHB-EGF людини стимулювати транспортування EGFR до ядра клітини.
- Дослідити шляхи ядерного транспортування sHB-EGF-стимульованого EGFR та роль тирозин-кіназної активності рецептору у цих процесах.
- Дослідити здатність sHB-EGF/EGFR ліганд-рецепторного комплексу взаємодіяти із промоторною ділянкою гену цикліну D1.
Методи дослідження − при виконанні роботи було використано молекулярно-біологічні, біохімічні, імунологічні, імунохімічні, мікробіологічні методи та методи роботи із культурою клітин евкаріот.
Наукова новизна одержаних результатів.
1. Виявлено новий механізм реалізації біологічної активності розчинної форми HB-EGF людини, що полягає у його здатності стимулювати транспортування EGFR до ядра клітини.
2. Виявлено, що утворений sHB-EGF/EGFR ліганд-рецепторний комплекс транспортується до ядра клітини ретроградним шляхом.
3. Виявлено здатність розчинної форми HB-EGF транспортуватися до ядра клітини у складі sHB-EGF/EGFR ліганд-рецепторного комплексу.
4. Встановлено, що тарозин-кіназна активність EGFR має лише частковий вплив на здатність рецептора транспортуватися до цис-мембран АГ та ЕПР. Проте, у подальше транспортування до ядра клітини можуть залучатися лише ті ліганд-рецепторні комплекси, до складу яких входять активні форми рецептору.
5. Виявлено, що транспортований до ядра клітини sHB-EGF/EGFR ліганд-рецепторний комплекс володів здатністю взаємодіяти із промоторною ділянкою гену цикліна D1.
6. Вперше отримано генетичні конструкції на основі невірусних систем експресії, що можуть бути використані для подальших досліджень молекулярних механізмів реалізації біологічної активності sHB-EGF у клітинах та на організменному рівні.
Також, на основі отриманого рекомбінантного аналогу sHB-EGF було запропоновано принцип детектування рівня протективних антитіл проти ДТ та виявлення активних форм токсину, а також, створено промислові зразки тест-систем «IBChem-AntiDiTox» та «IBChem-DiTox».