Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 14 червня 2016 р. (вівторок) о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь д.б.н. Шатурського О.Я. та К.Ю.Манойлова (ІБХ НАНУ, відділ нейрохімії та відділ молекулярної імунології) та колег, тема доповіді: «Характеристика рекомбінантних протеїнів CRM197 та субодиниці В як інструмента дослідження дифтерійного токсину». Авторські тези доповіді, як завжди, додаються. Семінар відбудеться під головуванням проф. М.М.Великого. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
З повагою – С.О.Костерін.
Характеристика рекомбінантних протеїнів CRM197 та субодиниці В, як інструмента дослідження дифтерійного токсину
К.Ю. Манойлов1, O.Б. Горбатюк2,3, М.О. Усенко2,3, О.Я. Шатурський1, T.O. Борисова1, Д.В. Колибо1
1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
2Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ
3Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини Національної академії медичних наук України", Київ
E-mail:
Доповідачі: О.Я. Шатурський, К.Ю. Манойлов
Очищення експресованих у клітинах E.coli нетоксичного дифтерійного токсоїда CRM197 та субодиниці В (рекомбінантне сполучення рецепторного та трансмембранного доменів дифтерійного токсину), проведене за допомогою метал-афінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дозволило позбутися домішків ендогенних пора-формуючих протеїнів. Показано, що мічений флуоресцеїн ізотіоціанатом препарат CRM197 та сполучення субодиниці В з флуоресцентним протеїном EGFP виявляють спроможність до зв’язування та інтерналізації клітинами ссавців ліній Vero та L929. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання СRM197 або субодиниці В (2нM-20нM) до фосфатидилетаноламін-вміщуючої бішарової мембрани (БЛМ) у розчині 1MKCl (pH 4,8 з боку додавання протеїнів та рН 6.0 з протилежного боку мембрани) призводило до утворення потенціалозалежних іонних каналів з провідністю близько 20 пСм, як показано у класичних дослідженнях дифтерійного токсину природного походження1. Трансмембранний струм каналами СRM197 та субодиниці В змінював напрямок за умов прикладання потенціалу -45+5мВ у 10-кратному градієнті концентрації КСl (1М КСl, рН 6,0 з боку прикладання потенціалу; 0,1 М КСl, рН 6,0 з протилежного боку модифікованої мембрани), що свідчить про переважну селективність утворених каналів до катіонів. Енергія активації, визначена для стаціонарного струму каналами CRM197 у розчині 1М КСl (pH 6,0) та самого розчину без БЛМ, становила 2,967±0,167 ккал/моль і 2,933±0,115 ккал/моль, відповідно, що підтверджує дані про утворення дифтерійном токсином та його іон-провідними похідними водної пори в плазматичній мембрані клітин-мішеней. Одержані дані співпадають з результатами попередніх досліджень дифтерійного токсину1 і його похідних2,3, що надає можливість використовувати отримані нами препарати CRM197 та субодиниці В для визначення геометрії трансмембранного домену іон-провідного олігоміра дифтерійного токсина з метою виявлення і застосування синтетичних органічних блокаторів каналів дифтерійного токсину і його похідних на штучних і природних мембранах4.
Література: 1. Donovan J.J., Simon M.I., Draper R.K., and Montal M. Diphtheria toxin forms transmembrane channels in planar lipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1981. – 78, № 1. – P. 172-176; 2. Kagan B.L., Finkelstein A., Colombini M. Diphteria toxin fragment forms large pores in phospholipid bilayer membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1981. – 78, № 8. – P. 4950-4954; 3. Hoch D. H., Romero-Mira M., Ehrlich B.E., Finkelstein A., DasGupta B.R., Simpson L.L. Channels formed by botulinum, tetanus, and diphtheria toxins in planar lipid bilayers: Relevance to translocation of proteins across membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. -82, P. 1692-1696; 4. Papini E., Sandona D.,
Rappuoli' R., Montecucco C. On the membrane translocation of diphtheria toxin: at
low pH the toxin induces ion channels on cells // The EMBO Journal. -1988. -7, №11, P.3353-3359.