Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету

Шановні колеги! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою діяльність.

27-го лютого (вівторок) о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь м.н.с. відділу біохімії вітамінів і коензимів Мазанової Анни Олександрівни (Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.)  «Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. До цього листа, як завжди, додаємо файл із авторськими тезами доповіді.

Запрошую Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою – С.О.Костерін.

Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету

Мазанова Анна Олександрівна, м.н.с., Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Актуальність: Упродовж останніх 20 років спостерігається значний прогрес у розумінні метаболізму та механізмів сигналювання вітаміну D. Вітаміни групи D (D₃ та D₂) наразі розглядають не лише як регулятори процесів кісткового ремоделювання, але і як сполуки, що впливають на проліферацію та диференціювання клітин, ангіогенез і апоптоз. Вітамін D-дефіцитний стан асоціюють з розвитком низки патологічних станів, серцево-судинних, онкологічних та автоімунних захворювань, передусім цукрового діабету 1 типу (ЦД 1). Саме тому характеристика вітамін D-статусу організму є важливим діагностичним параметром у сучасній клінічній практиці. На сьогодні на ринку наявний ряд методів, що дозволяють вимірювати вміст 25OHD (головного маркера забезпеченості організму вітаміном D) у серологічних зразках. До цих методів належать: a) високоефективна рідинна хроматографія у поєднанні з масспектометрією (HPLC, LC/MS); б) радіоконкурентний/імунний аналіз (RIA); в) імуноензимний аналіз (ELISA). Більшість з цих методів є складними у виконанні, потребують великих об’ємів зразка та дорогого обладнання (HPLC) або передбачають роботу зі шкідливими речовинами (RIA). Натомість ELISA-формат дозволяє швидко та безпечно робити визначення одночасно у 50-60 зразках. Наявні на ринку комерційні системи для визначення 25OHD є занадто дорогими. Враховуючи це, метою роботи була: розробка та конструювання імуноензимного вітчизняного діагностикуму для визначення рівня 25ОНD  у сироватці крові за умов розвитку цукрового діабету 1 типу. Для досягнення мети було поставлено ряд завдань:

1. Синтез імуногенних кон’югатів похідних 25ОНD_3, що містили активну карбоксильну групу, з протеїнами-носіями - гемоціаніном молюсків (KLH) та альбуміном курячого яйця (OVA), імунізації кролів та характеристика отриманих поліклональних антисироваток методом непрямого ELISA;
2. Конструювання імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD у серологічних зразках та подальша розробка методу візуалізації сигналу з використанням біотин-стрептавідинової системи. Відпрацювання схеми постановки реакції та оптимізація умов сорбції антитіл на поверхні полістиролових планшетів, дослідження різних режимів проведення реакції конкуренції та проведення валідації створеної тест-системи за рядом стандартних характеристик;
3. З’ясування ролі вітаміну D₃ у регулюванні експресії 25ОНD₃-1α-гідроксилази (CYP27B1) та рецепторів вітаміну D₃ (VDR) за стрептозотоцин (STZ)- індукованого цукрового діабету 1типу.

Результати: В роботі вперше було продемонстровано синтез кон’югатів 25OHD₃ з KLH та OVA з використанням модифікованого карбодиімідного методу. Було проведено очищення створених кон’югатів методом гель фільтрації та визначено співвідношення молекул гаптену до протеїну-носія за допомогою тонкошарової хроматографії. Застосування кон’югата 25OHD₃-KHL дало змогу отримати поліклональні кролячі антитіла проти 25OHD, які було очищено та охарактеризовано за допомогою непрямого імуноензимного аналізу. Було показано, що титр специфічних антитіл знаходився в межах 1:1000-1:10000, антитіла не втрачали своєї активності та специфічності після процедур преципітації за допомогою сульфату амонію та діалізу. Було вперше сконструйовано вітчизняну імуноензимну тест-систему для визначення 25OHD у сироватці крові з біотин-стрептавідиновим конкурентним способом візуалізації сигналу та проведено її валідацію за рядом стандартних характеристик: побудовано стандартну калібрувальну криву, визначено ліміт детектування, кількісний ліміт та коефіцієнти варіативності (внутрішньосистемний - Inter CV і міжсистемний - Intra CV). Проведено тестування «матричного ефекту» гемоглобіну, білірубіну і тригліцеридів та показано, що за умов використання негемолізованих зразків дані сполуки не чинять інгібувального впливу на проведення процедури аналізу. Було встановлено, що перехресна реактивність системи з іншими метаболітами вітаміну D лежить у межах 10%. Продемонстровано зміни синтезу ключових елементів вітамін D- ендокринної системи (вміст мРНК і протеїну VDR та CYP27B1) у печінці, нирках, кістковій тканині і кістковому мозку за ЦД 1 та встановлено доцільність використання вітаміну D₃, як засобу корекції діабет-індукованих порушень у синтезі вітамін D рецепторів та 25OH₃-1α гідроксилази у досліджуваних тканинах.