ДУ “ІМІ ім. І.І. Мeчникова АМН України”Лиманської О.Ю. “Молекулярні технології в типуванні та детекції патогенів бактеріальної і вірусної етіології”

Актуальність. Незважаючи на різноманіття методів детекції та типування інфекційних агентів як вірусної, так і бактеріальної етіології, залишається актуальним питання підвищення якісного рівня індикації та диференціації патогенів на основі молекулярно-генетичних технологій. Для вирішення ряду задач в області молекулярної медицини та біотехнології широке розповсюдження отримали ДНК-маркери, активне використання яких обумовлено, з одного боку, обмеженнями, властивими фенотиповим методам, а з іншого боку, розвитком методичної бази та появою нових методологічних підходів.

Мета роботи полягала в розробці молекулярних технологій диференціації та детекції патогенів людини та тварин з використанням сучасних методологічних підходів на основі структурної організації їх геномів.

Методи дослідження. Для досягнення мети та вирішення поставлених у роботі задач використовували наступні методи дослідження: комп’ютерний аналіз секвенованих послідовностей генів або їх фрагментів патогенів людини та тварин, полімеразну ланцюгову реакцію, УФ-спектроскопію з термічною денатурацією, атомно-силову мікроскопію.

Результати. У роботі створено молекулярну технологію диференціації мікобактерій туберкульозу дикого типу та резистентних до протитуберкульозного препарату першого ряду ізоніазиду з використанням LNA-модифікованих праймерів. Розроблено технологію визначення варіантів точкових мутацій в кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу, асоційованих з резистентністю до ізоніазиду, на основі алель-специфічної ПЛР з додатковим блокуючим праймером. Ефективність пропонованого підходу продемонстрована з використанням ДНК, екстрагованої із штамів M. tuberculosis з різним рівнем резистентності до ізоніазиду.

На основі поліморфізму поодиноких нуклеотидів гена gyr B з використанням методики хитного нуклеотида, локалізованого на 3''-кінці одного з праймерів, розроблено молекулярно-генетичні набори для: 1) диференціації близькоспоріднених мікобактерій туберкульозного комплексу M. tuberculosis, M. canettii, M. microti, M. bovis та M. caprae; 2) видоспецифічної детекції бактерій групи B. сereus; 3) для родо- та видоспецифічної детекції протеїв. Для диференціації патогенних і непатогенних штамів B. anthracis сконструйовану видоспецифічну тест-систему доповнено праймерами, комплементарними послідовностям плазмід pXO1 та pXO2, що визначають вірулентність штаму.

Створено молекулярно-генетичні тест-системи для детекції та генотипування шести видів патогенних та непатогенних лістерій шляхом проведення гніздової ПЛР.

Проведено типування одного з розповсюджених ретровірусів тварин – вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ), циркулюючого в Україні, та за результатами ПДРФ-аналізу та секвенування встановлено належність українського ізоляту до австралійського підвиду – одного з трьох відомих підвидів цього патогена. Розроблено набір праймерів для детекції провірусної ДНК іншого небезпечного ретровірусу тварин – вірусу імунодефіциту ВРХ.

Вперше проведено пошук досконалих і недосконалих інвертованих та поліпурінових /поліпирімідінових дзеркально-симетричних повторів з потенціалом утворення шпилькових структур та триплексів відповідно у провірусній ДНК зазначених ретровірусів, створено фізичні карти локалізації шпилькових структур та триплексів. Показано, що розподіли шпильок та триплексів у геномах ретровірусів тварин відрізняються якісно та кількісно. Запропоновано моделі потенційних міжланцюгових триплексів у провірусній ДНК обраних ретровірусів. Створено фізичні карти локалізації термодинамічно стабільних досконалих та недосконалих шпилькових структур в геномній РНК низки коронавірусів людини та тварин. Запропоновано побудовані карти локалізації неканонічних структур використовувати для структурної диференціації геномів вірусів та бактерій.