Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою роботу. 20-го грудня (вівторок) 2011 р. о 10-30 ранку в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь Ржепецького Юрія Анатолійовича “Роль фосфорилювання адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в регуляції біологічних відповідей клітин“ (Інститут біології клітини НАН України, відділ сигнальних механізмів клітини). Доповідь буде зроблено за матеріалами кандидатської дисертації, що готується до захисту. Традиційно до цього листа додаємо авторські тези доповіді. Будемо раді побачитись з Вами на засіданні нашого семінару! З повагою, Ваш - С.О.Костерін.
“Роль фосфорилювання адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в регуляції біологічних відповідей клітин“
Ржепецький Юрій Анатолійович
Інститут біології клітини НАН України, відділ сигнальних механізмів клітини
Наявні експериментальні дані дозволяють вважати Ruk/CIN85/SETA/CD2BP3 представником окремої родини SH3-вмісних адаптерних протеїнів, які виконують інтегруючу роль у регулюванні ліганд-індукованого ендоцитозу рецепторних тирозинових протеїнкіназ та внутрішньоклітинного транспорту ендоцитних везикул, апоптозу, функціонального стану актинового цитоскелету, адгезії, інвазивності, мітогенному сигналюванні, інфікуванні клітин вірусом простого герпесу. Як типовий адаптерний протеїн Ruk/CIN85 реалізує свою біологічні функції, взаємодіючи з іншими сигнальними молекулами за допомогою спеціальних сигнальних послідовностей: SH3 доменів, Pro-багатих послідовностей та суперспіралізованого «coiled-coil» домену. Функціональні дані стосовно участі Ruk/CIN85 у регулюванні гомеостазу клітин як за умов норми, так і патологій різного генезу, свідчать про те, що його біологічна активність повинна бути об’єктом строгого контролю зі сторони різноманітних клітинних регуляторних систем. В літературі є дані стосовно моноубіквітилювання Ruk/CIN85 по множинних центрах за участю убіквітинлігаз c-Cbl/Cbl-b та Nedd4 та ролі цього процесу в ліганд-індукованому ендоцитозі рецепторних тирозинових протеїнкіназ. Водночас, жодних даних стосовно фосфорилювання Ruk/CIN85 і протеїнкіназ, залучених до цього процесу, та біологічної значимості зазначеної посттрансляційної модифікації на сьогодні не опубліковано.
В дисертаційній роботі вперше показано, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 зазнає посттрансляційної модифікації in vivo шляхом фосфорилювання. Зокрема, метаболічним міченням Т-лімфомних клітин лінії Jurkat ортофосфатом Н332РО4 з наступною імунопреципітацією анти-Ruk антитілами, розділенням протеїнів в ПААГ і авторадіографією продемонстровано інтенсивне включення радіоактивного фосфату до складу досліджуваного протеїну за конститутивних умов. Фосфорилювання Ruk/CIN85 досліджували також на моделі клітин феохромоцитоми щура лінії PC12, з індуцибельною надекспресією повнорозмірної і середньої Flag-tagged ізоформ Ruk/CIN85. З використанням панелі фосфоспецифічних антитіл показано, що стимуляція клітин РС12 EGF та NGF супроводжується фосфорилюванням єдиного залишку тирозину у складі Rukl/CIN85, локалізованого у положенні 10. Фосфорилювання по залишках серину та треоніну детектується при стимуляції NGF і не виявляється при стимуляції EGF. За допомогою «Phospho Protein Purification Kit» (Quiagen) було здійснено очищення загального пулу фосфорильованих протеїнів з клітин PC12 із індуцибельною експресією Rukm Flag-tagged. Анти-Flag імуноблот-аналізом продемонстровано, що лише незначна частина пулу експресованої середьої форми Rukm фосфорилюється по залишках Ser/Thr при дії NGF. Отримані дані дозволяють зробити припущення, що фосфорилювання Ruk/CIN85 по залишках Tyr/Ser/Thr відіграє регуляторну роль в процесі NGF-індукованого нейронального диференціювання клітин РС12. Імунопреципітацією з наступною кіназною реакцією in vitro встановлено, що в клітинах ембріональної нирки людини лінії HEK293, тимчасово трансфікованих конструктом, що кодує повнорозмірну і середню Glu-tagged ізоформи Ruk/CIN85, адаптерний протеїн взаємодіє з кіназами, здатними фосфорилювати його. Стимуляція клітин ембріональною сироваткою та інсуліном призводить до зростання включення 32P з [?-32P]ATP до складу повнорозмірної форми Ruk/CIN85 та пригнічення фосфорилювання середньої форми.
Проведений аналіз амінокислотної послідовності Ruk/CIN85 за допомогою програм NetPhos та Scansite дозволив передбачити наявність більше 30 центрів фосфорилювання для різних ізоформ протеїнкінази С, казеїнкінази ІІ, АТМ кінази, РКС?. Серед протеїнкіназ, потенційно здатних фосфорилювати досліджуваний протеїн, особливу увагу привертає РКС?. На сьогодні, РКС? відносять до нової родини Ser/Thr кіназ групи Са2+/кальмодулін-залежних кіназ, яка включає PKD1/PKC?, PKD2 та PKD3/PKC?. По-перше, на N-кінці PKD1 і PKD2 локалізований неполярний район, багатий на залишки проліну. По-друге, як PKD1, так і Ruk/CIN85 були виявлені в інвадоподіях, спеціалізованих видовженнях плазматичної мембрани у місцях деградації позаклітинного матриксу, в надмолекулярних комплексах, що включали спільні компоненти. Співімунопреципітацією з лізатів клітин НЕК293 Ser/Thr-срецифічна PKD вперше ідентифікована як зв’язувальний партнер Ruk/CIN85. З метою локалізації ділянок, відповідальних за виявлену взаємодію, було зконструйовано плазмідні вектори для експресії GST-злитих фрагментів Ruk/CIN85 в бактерійній системі та отримано афінно очищені препарати рекомбінантних протеїнів. Преципітацією PKD2-Flag з лізатів тимчасово трансфікованих клітин НЕК293 за допомогою отриманих GST-злитих фрагментів Ruk/CIN85 було показано, що PKD2 взаємодіє з SH3В, та, частково, з SH3С доменом Ruk/CIN85, причому присутність одночасно обох вказаних доменів суттєво посилює цю взаємодію. При використанні як «байту» GST-SH3ABC посилення зв’язування не спостерігалось. Водночас, з’ясувалося, що найефективніше PKD2 взаємодіє з Pro-багатою ділянкою Ruk/CIN85, хоча і не містить Pro-зв’язувальних доменів у своєму складі. Також, виявлено низький рівень зв’язування PKD2 із суперспіралізованою ділянкою, що, частково, може бути зумовлено олігомеризацією ендогенного протеїну Ruk/CIN85 з GST-Rukcc. Ефективність преципітації конститутивно неактивних форм PKD1 та PKD2 була нижчою порівняно з конститутивно активними. Для з’ясування, чи дійсно PKD2 використовує Ruk/CIN85 як субстрат, було проведено кіназну реакцію in vitro в анти-PKD2-Flag імунопреципітатах з використанням окремих GST-злитих фрагментів Ruk/CIN85 як субстратів. Встановлено, що найвищий рівень включення 32Р з [?-32Р]ATP спостерігається у SH3AB фрагмент і значно нижчий у SH3ABС, SH3BС та SH3B фрагменти. Ефективність модифікації SH3AB фрагменту корелює з присутністю передбачуваних центрів фосфорилювання для PKD у положенні Тhr88, що локалізований у спейсерній ділянці між SH3A і В доменами, та Тhr144 у складі SH3B домену. Водночас, присутність SH3С домену накладає конформаційні обмеження на доступність центрів фосфорилювання для кінази, що призводить до зниження включення 32Р в SH3ABС, SH3BС та SH3B фрагменти.
За допомогою конфокальної мікроскопії показано співлокалізацію Ruk/CIN85 та PKD2 в клітинах MCF-7, стабільно трансфікованих pEGFP-Rukl/CIN85, в ділянках формування ламеліподій та актин-багатих мембранних складок, які, як відомо, відповідають за міграцію клітин. Встановлено також, що Ruk/CIN85 взаємодіє з актин-зв’язувальним протеїном кортактином який, у свою чергу, також є зв’язувальним партнером та субстратом PKD. Таким чином, можна припустити існування комплексу Ruk/CIN85-PKD-кортактин, асоційованого з актином, що здатний модулювати функціональний стан актинового цитоскелету, впливаючи, таким чином, на процес міграції клітин.