Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою роботу. 27-го грудня (вівторок) 2011 р. о 10-30 ранку в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь молодшого наукового співробітника відділу структури і функції білка інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України Позняк Тетяни Анатоліївни «Локалізація нових центрів полімеризації в молекулі фібрину і пошук низькомолекулярних сполук, які блокують ці центри». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Традиційно до цього листа додаємо авторські тези доповіді. Будемо раді побачитись з Вами на засіданні нашого семінару! З повагою - С.О.Костерін.
«Локалізація нових центрів полімеризації в молекулі фібрину і пошук низькомолекулярних сполук, які блокують ці центри»
Позняк Тетяна Анатоліївна, молодший науковий співробітник відділу структури і функції білка інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України
Центральним білком системи зсідання крові є білок фібриноген, в якому розрізняють центральний регіон Е, два периферійні регіони D та два ?С-регіони (А?220-610). При активації системи зсідання крові тромбін перетворює фібриноген на фібрин desА, який полімеризується з утворенням протофібрил. Далі тромбін в утворених протофібрилах від фібринів desА відщеплює фібринопептиди В і перетворюється його на фібрин desАВ, що призводить до посиленню латеральної асоціації протофібрил. Молекулярні механізми процесу полімеризації фібрину, який веде до формування фібринового каркасу тромбу на сьогоднішній день повністю ще не з’ясовані.
Мета досліджень полягала в локалізації невідомих сайтів полімеризації фібрину, з’ясуванню просторової орієнтації та функціональної ролі ?С-регіонів молекули фібриногену в процесі його перетворення в полімерний фібрин, а також пошуку специфічних низькомолекулярних інгібіторів цього процесу, що перешкоджають тромбоутворенню.
Для досягнення поставленої мети було вирішено наступні завдання:
1. Отримано моноклональні антитіла (монАТ) з епітопом в ?С–регіоні молекули фібрин(оген)у та визначено їх імунохімічні характеристики.
2. Досліджено зміни просторової орієнтації та функціональної ролі ?С–регіонів на різних етапах процесу полімеризації фібрину з використанням отриманих монАТ.
Досліджено здатність синтетичних пептидів, які імітують амінокислотну послідовність фрагментів фібрину, що містять "пролінові дужки", інгібувати полімеризацію фібрину.
3. Досліджено ряд каліксаренів як можливих інгібіторів полімеризації фібрину та тромбоутворення.
Отримано моноклональні антитіла (монАТ FnII-2M) класу IgM. Методом Western blot та ELISA встановлено, що епітопом для них знаходиться у фрагменті А?240-491 ?С-регіону фібрин(оген)у людини. З’ясовано, що монАТ FnII-2M не реагують з нативним фібриногеном та фібрином desА і проявляють специфічність лише до фібрину desАВ. Методом ELISA показана кінетика експонування епітопу для монАТ FnII-2M, по мірі послідовного перетворення фібриногену у фібрин desАВ. За допомогою монАТ FnII-2M отримано прямий доказ того, що не лише в нативній молекулі фібриногену, як було показано раніше, але і в мономерному фібрині desА людини ?С-регіони зв’язані з фібринопептидами В, а після їх відщеплення від фібрину desА, що супроводжується утворенням фібрину desАВ вони відходять від остова молекули. Принципово новим є експериментальний доказ того, що цей зв’язок зберігається і в полімерному фібрині desA. Таким чином, очевидно, що після відщеплення фібринопептидів А, відбувається переорієнтація ?С-регіонів, вони відходять один від одного, відкриваючи центри «А», однак при цьому залишаються бути зв’язаними з фібринопептидами В.
Також на основі отриманих даних та комп’ютерного моделювання вперше було отримано три реально можливі моделі просторового орієнтації ?С-регіонів в молекулах: фібриногену, де ?С-регіони зв’язані з фібринопептидами А, В та між собою; фібрину desА, де ?С-регіони залишаються бути зв’язаними лише з фібринопептидами В; фібрину desАВ, де ?С-регіони відщеплюються від фібринопептидів В та відходять від остова молекули фібрину. Таким чином, очевидно, що лише після відщеплення фібринопептидів В, ?С-регіони відходять від остова молекули фібрину desА у складі протофібрил та сприяють взаємопросторовій орієнтації протофібрил, прискорюючи їх латеральну асоціацію. Це відбувається за рахунок переключення внутрішньомолекулярних контактів ?С-регіонів на міжмолекулярні. При аналізі отриманих та літературних даних, встановлено, що ?С-регіони міжпротофібрилярно взаємодіють своїми фрагментами А?392-491. Таким чином, отримано нову інформацію про молекулярні механізми участі ?С-регіонів в процесі полімеризації фібрину.
За допомогою синтетичних пептидів, які імітують амінокислотні послідовності фрагментів фібриногену типу «пролінових дужок» було вперше локалізовано в D-домені молекули фібрину нові сайти, які приймають участь в процесі його полімеризації і знаходяться у фрагментах ?69-77 і ?195-205. При використанні методу турбідиметричного аналізу та електронної мікроскопії в системі фібриноген+тромбін було встановлено, що пептид A?195-205 інгібує першу стадію полімеризації фібрину - побудову протофібрил. Встановлено, що синтетичний пептид ?69-77 є самим ефективним низькомолекулярним пептидним інгібітором полімеризації фібрину (IC50=1,5·10-5М). Отримані результати окрім фундаментальних знань містить ще і практичну сторону, оскільки зважаючи на дуже низькі значення IC50 відносно процесу полімеризації фібрину для досліджуваних синтетичних пептидів (1,5·10-5М для ?69-77 та 2,38·10-4М для A?195-205), вони можуть бути використані у розробці на їх основі антитромботичних препаратів.
Вперше було знайдено високоефективні низькомолекулярні органічні інгібітори процесу полімеризації фібрину та зсідання плазми крові людини - калікс[4]арен метиленбісфосфонова кислота (С-192) та його натрієва сіль (С-145). Встановлено, що при концентрації каліксарену С-192 (5,11,17,23-біс(дигідроксифосфорил)метилкалікс[4]арену) рівній 0,5?10-6М максимальна швидкість полімеризації фібрину зменшувалась на 50% (IC50). Методом електронної мікроскопії встановлено, що калікс[4]арен С-192 інгібує процес полімеризації фібрину на стадії побудови протофібрил. Методом HPLC-аналізу встановлено, що калікс[4]арен С-192 зв’язується з синтетичним пептидом GPRP, який імітує сайт полімеризації «А». Таким чином, калікс[4]арен С-192 інгібує полімеризацію фібрину блокуючи центр полімеризації «А» (A?17Gly-Pro-Arg), що перешкоджає його взаємодії з комплементарним йому сайтом “a”. Показано, що додавання калікс[4]арену С-192 до нормальної плазми крові приводить до збільшення як протромбінового часу (IC50=7,0·10-5 M), так і активованого часткового тромбопластинового часу (IC50=1,7·10-5M). Встановлено, що калікс[4]арени С-192 і С-145 не впливають на активність фактора Ха і тромбіну, а також на процес агрегації тромбоцитів, що свідчить про високу специфічність інгібування процесу полімеризації фібрину цими калікс[4]аренами. Таким чином, досліджені низькомолекулярні калікс[4]арени С-192 і С-145 можуть бути використані як матриця для створення нового класу антитромботичних препаратів.
Наукову новизну одержаних результатів підтверджено патентом України на винахід № 26720/ЗА/11 та прийнятою заявкою на міжнародний патент No PCT/UA2011/000026.
За темою дисертації опубліковано 17 робіт, які включають 4 статті у фахових виданнях, 1 патенту на винахід та тези 12 доповідей і стендових презентацій на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях, з’їздах, конгресах, 1 стаття прийнята до друку.
1. П.Г. Гриценко, Е.В. Луговськой, Т.А. Кошель, С.О. Черенок, О.А. Ющенко, Чернишов, В.І. Кальченко, С.В. Комісаренко Вплив каліксарен-метиленбісфосфонових кислот на полімеризацію фібрину. // Доп. НАН України. — 2010. — N 1. — С. 175-179.
2. E.V. Lugovskoi, P.G. Gritsenko, T.A. Koshel, I.O. Koliesnik, S.O. Cherenok, O.I. Kalchenko, V.I. Kalchenko , S.V. Komisarenko. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as inhibitors of fibrin polymerization // FEBS J. – 2011. – 278, P. 1244-1251.
3. S. O. Cherenok; O. A. Yuschenko; P. G. Gritsenko; E. V. Lugovskoy; T. A. Koshel; V. I. Chernishov; I. O. Koliesnik; O. I. Kalchenko; S. V. Komisarenko; V. I. Kalchenko. Synthesis of Calixarene-Methylenebisphosphonic Acids and Their Influence on Fibrin Polymerization // Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements, - 2011. - 186: 4, P. 964 — 965.
4. Кошель Т.А., Чернышеко В.А., Черенок С.А.. Колесник Е.А. Исследование механизма ингибирования полимеризации фибрина каликсаренбисфосфоновыми кислотами // «Известия Национальной академии наук Беларуси» - IV квартал 2011 р.
5. Т.А. Позняк, І.М. Колеснікова, Є. М. Макогоненко, Л.М. Литвинова, О.М. Костюченко, Г.К. Гоголінська, М.О. Пидюра, С.І. Андріанов, Е.В. Луговськой, Комісаренко С.В. Зміни просторової орієнтації aС-регіонів фібриногену в процесі його трансформації в полімерний фібрин // Доп. НАН України. – прийнята до друку.
Позитивне рішення про видачу патенту на винахід № 26720/ЗА/11 від 21.10.2011 за заявкою № a 2010 04273. МПК (2006) С 07H 21/00, A 61K 31/00. 5,11,17,23-Тетракіс[дигідроксифосфорил]калікс[4]арен або його Na-сіль як інгібітори полімеризації фібрину / Комісаренко С. В., Луговськой Е. В., Гриценко П. Г., Кальченко В. І., Кошель Т. А., Черенок С. О., Ющенко О. А., Колесник Є. О. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Інститут органічної хімії НАН України. – заявл. 13.04.10.