Примітка:
До збірки включено попередній варіант тез доповідей учасників конференції-конкурсу робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2012” в авторській редакції.
Кінцевий варіант тез буде опубліковано в найближчому номері “Українського біохімічного журналу” за 2012 рік. Тези доповідей молодих учених, що не візьмуть участі у конференції, опубліковані не будуть.
Порядок денний Конференції молодих учених
22 травня
9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – Вступне слово академіка С.В.Комісаренка
10.15 – І пленарне засідання конференції
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІІ пленарне засідання конференції
17.00 – Завершення роботи першого дня конференції
23 травня
9.30 – Реєстрація учасників конференції
10.00 – ІІІ пленарне засідання конференції
13.00 – Обідня перерва
14.00 – ІV пленарне засідання конференції
16.00 – Підведення підсумків, нагородження переможців,
закриття конференції.
Тривалість доповіді не повинна перевищувати 10 хвилин, а відповідей на запитання – 5 хвилин.
Мова доповіді – українська, російська або англійська.
УДК 616.12-002.4-092.9
Г.Г. БАБАЄВА, М.О. ЧИЖ
БІОТЕХНОЛОГІЧНІ ПІДХОДИ ДО МОДЕЛЮВАННЯ НЕКРОЗУ МІОКАРДА
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків;
Для правильного розуміння сутності інфаркту міокарда, і для розробки методів його профілактики та лікування безсумнівне значення має його експериментальне відтворення.
Мета роботи - вивчення деструктивно-відновних процесів після пошкодження міокарда, викликаного перев'язкою лівої коронарної артерії та локальною кріодеструкцією лівого шлуночка.
Матеріали і методи. Робота проведена на безпородних щурах масою 180-250 г. Ішемічний некроз міокарда (НМ) моделювали шляхом механічної перев'язки лівої коронарної артерії. Кріовплив на стінку лівого шлуночка проводили кріоінструментом з діаметром аплікатора 3 мм. Електрокардіограми (ЕКГ) реєстрували та аналізували на апаратно-програмному комплексі «Поліспектр-8 / В». Прижиттєву мікроскопічну картину серця оцінювали за допомогою контактного мікроскопа ЛЮМАМ К-1. Гістологічні дослідження міокарда проведено на 1, 7, 14 і 30 добу.
Результати та обговорення. «Класична» модель ішемічного НМ шляхом перев'язки лівої коронарної артерії призводила до інтраопераційної смертності до 30%. У більшості випадків причиною летальних випадків був відкритий пневмоторакс. При кріовпливі на стінку лівого шлуночка загибелі тварин не спостерігалося. За даними електрокардіографічного дослідження виявлено, що після перев'язки коронарної артерії реєстрували зубець Q з елевацією сегмента ST в I, avL відведеннях, що вказувало на формування передньо-бокового НМ. При кріовпливі на міокард протягом 15 сек відзначали зниження амплітуди зубців R, появу зубця q і негативних зубців Т в I, avL або в III і avF відведеннях, що свідчило про розвиток у тварин субепікардіального НМ. Збільшення дози кріовпливу до 30 сек призводило до появи трансмурального НМ, що підтверджувалося наявністю зубця Q у відповідних відведеннях. Проведене дослідження мікрогемоциркуляторного русла серця показало виражені відмінності гемодинаміки і мікроструктури в центральних і пограничних зонах пошкодження міокарда на 14-у добу. Показники мікроциркуляторного русла в периферичних областях серця після перев'язки лівої коронарної артерії відновлювалися швидше в порівнянні з кріоушкодженням серця. Дослідження морфологічних змін серця показали, що організація сполучнотканинного рубця після локальної кріодеструціі серця відбувалася на 7 діб швидше, ніж після перев'язки коронарної артерії.
Висновки. Кріохірургічний метод моделювання некрозу міокарда дозволяє прогнозувати зону і ступінь ушкодження міокарда в залежності від тривалості впливу на серце низькими температурами. Моделювання некрозу міокарда шляхом перев'язки лівої коронарної артерії призводить до розвитку у тварин переднебокового трансмурального некрозу міокарда.
УДК 577.21:612.34:616.33-008.821.14
Т.В.БОРОДІНА, С.Є. ВАКАЛ, А.С. ДРАНИЦИНА, К.О. ДВОРЩЕНКО, Л.І. ОСТАПЧЕНКО
ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ CCKBR, GAST, REG1?, TGF?1 У ПІДШЛУНКОВІЙ ЗАЛОЗІ ЩУРІВ ЗА УМОВ ТРИВАЛОЇ ГІПОХЛОРГІДРІЇ ТА ПРИ ВВЕДЕННІ МУЛЬТИПРОБІОТИКА «СИМБІТЕР® АЦИДОФІЛЬНИЙ» КОНЦЕНТРОВАНИЙ
ННЦ “Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Київ;
Вступ. Значне місце серед патологій травної системи займає гіпохлоргідрія (поліетіологічне порушення секреції гідрохлоридної кислоти парієтальними клітинами шлунка). Наслідком тривалої гіпохлоргідрії є розвиток дисбіозу та колонізація шлунково-кишкового тракту (ШКТ) патогенною мікрофлорою, яка може сприяти запальним процесам та канцерогенезу в ШКТ і асоційованих органах. Так, відомо, що за умов зниженої кислотності виникає загроза розвитку гострого панкреатиту та онкологічних захворювань підшлункової залози (ПЗ). Ефективним терапевтичним засобом проти дисбіозів є пробіотичні препарати.
При панкреатичному канцерогенезі різної етіології у ПЗ спостерігається аномальна експресія генів Reg1?, Cckbr, Gast та Tgfb1. Тому метою роботи було визначити рівень мРНК генів Cckbr, Gast, Reg1? та Tgfb1 у ПЗ щурів за умов тривалої гіпохлоргідрії та при введенні мультипробіотика “Симбітер® ацидофільний” концентрований (Симбітер).
Методи. У дослідах використовували білих нелінійних статевозрілих щурів-самців із початковою вагою 180-200 г. Тварин розділяли на 4 групи (по 8 тварин в кожній). Першій групі протягом 28 діб вводили інтраперитонеально 0,2 мл води та перорально 0,5 мл (контроль). Гіпохлоргідрію моделювали внутрішньочеревним введенням 14 мг/кг омепразолу (друга група). Третій групі окрім омепразолу вводили перорально Симбітер в дозі 0,14 мл/кг. Четверта група отримувала лише Симбітер.
РНК отримували за методом Chomczynski et al. Підбір праймерів здійснено за допомогою пакету програм Vector NTI®. Синтез кДНК, полімеразну ланцюгову реакцію та електрофоретичне розділення ампліконів проводили відповідно до Sambrook et al. Напівкількісний аналіз експресії ампліконів на основі денситометрії здійснено в програмі ImageJ 1.45s.
Результати. Виявлено, що за умов тривалої гіпохлоргідрії вміст мРНК генів Cckbr, Reg1? та Tgfb1 перевищував контрольні значення у 1,8 разів, 2 рази та 1,4 рази відповідно. Окрім того, в цих умовах встановлено наявність мРНК гена Gast – в жодній іншій групі тварин її не виявлено. За умов одночасного введення мультипробіотика Симбітер (третя група) рівень мРНК генів Cckbr та Tgfb1 був нижчим, ніж у тварин другої групи в 1,8 разів та 1,7 разів відповідно. Вміст мРНК гена Reg1? в 1,7 разів перевищував цей у показник тварин, яким вводили лише омепразол. Рівень мРНК усіх чотирьох генів у четвертій групі тварин був аналогічним до контролю.
Висновки. Стан тривалої гіпохлоргідрії супроводжується зміною експресії генів Cckbr, Gast, Reg1? та Tgfb1 у ПЗ щурів, тоді як при введенні мультипробіотика Симбітер патерн експресії більшості з даних генів подібний до контролю.
УДК 576.32/.36
Г.В. БУДАШ, Д.І. БІЛЬКО, С.В. МАЛИШЕВА
ВДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДІВ ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ ЕМБРІОНАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ ТА ІНДУКОВАНИХ ПЛЮРИПОТЕНТНИХ КЛІТИН МИШІ В КАРДІОМІОЦИТИ
Центр молекулярних і клітинних досліджень Національного університету «Києво-Могилянська академія», Київ;
Вступ. Відновлення функції серцевого м’яза можливо завдяки застосуванню методів клітинної терапії, які дозволяють отримувати кардіоміоцити в культурі клітин in vitro (Yuasa S., 2008). Однак використання ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) у клітинній терапії має суттєві недоліки: етичні перепони пов'язані з необхідністю знищення людських ембріонів в процесі виготовлення ліній ЕСК та не співпадіння отриманих ліній з аутологічним генотипом пацієнтів (Yoshida Y., 2011). Застосування індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (ІПСК) могло б вирішити ці проблеми. Однак відсутність вичерпної інформації про властивості цих клітин, а також недосконалість наявних методів диференціювання є причиною необхідності дослідження та оптимізації методів диференціювання в кардіоміоцитарному напрямку.
Методи. Було досліджено 3 методи диференціювання ЕСК та ІПСК в кардіоміоцити через утворення ембріоїдних тілець (ЕТ): метод висячої краплі, метод культивувуння в суспензії культурі на орбітальному шейкері та метод формування ЕТ в AggreWell планшетах. Експерименти проводили на генетично модифікованих лініях ЕСК та ІПСК миші, які під контролем кардіоспецифічного ?-MHC-промотора експресували зелений флюорисцентний протеїн (eGFP). Кількісне визначення утворених клітин серця проводили методами проточної цитофлюорометрії та флюорисцентної мікроскопій.
Результати. Підтверджено, що методи диференціювання ЕСК можуть бути застосовані для диференціювання ІПСК. Під час диференціювання методом висячої краплі утворюються кластери eGFP+ клітин більші ніж при застосуванні будь-якого іншого методу диференціювання. Однак цей метод є трудомістким і не може бути застосований для масового отримання клітин серця. Метод формування ЕТ в AggreWell планшетах зменшує їх гетерогенність, проте має обмеження в кількості утворених агрегатів, і є економічно невигідним. Методом культивування в суспензійній культурі можна паралельно перевірити та порівняти кілька хімічних сполук, здатних до індукції диференціювання, і саме він дає максимальний вихід клітин серця.
Додавання циклоспорину з 4-го по 9-ий день формування ЕТ сприяло стабільному диференціюванню стовбурових клітин у клітини серця. Його дія збільшувала кількість еGFP+ клітин та площу скоротливих кластерів ЕТ. Загальна кількість кардіоміоцитів в групі з додаванням циклоспорину в 1,25-2 рази перевищувала кількість кардіоміоцитів отриманих в контрольній групі.
Висновки. Придатним для розробки ефективного протоколу диференціювання було визначено метод культивування клітин в суспензії, який дає можливість одночасно перевірити та порівняти кілька сполук. Застосування циклоспорину підвищувало ефективність диференціювання ЕСК та ІПСК в кардіоміоцити. Поєднання вибраного методу диференціювання та застосування циклоспорину може стати основою для розробки пацієнтспецифічної терапії серцево-судинних захворювань ІПС клітинами в майбутньому.
УДК [612.354+591.169.2]: 577.161.1
Г.П. КОПИЛЬЧУК, І.О.ШМАРАКОВ, І.М. БУЧКОВСЬКА
Вплив відсутності запасів ретиноїдів на активність ензимних систем детоксикації при регенерації печінки
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці;
Ензимні системи клітинної детоксикації, представлені численними ізоформами цитохрому Р-450 (CYP; 1.14.14.1) та ензимами біокон’югації – глутатіон-S-трансферазами (GST; 2.5.1.18), відіграють провідну роль у підтриманні повноцінного метаболізму, що визначає резистентність клітин і тканин організму до розвитку патологічних станів та забезпечують ефективну тканинну відповідь на гостре ураження.
Мета роботи – дослідити вплив відсутності запасів ретиноїдів на рівень гідроксилазної активності цитохрому Р-450 та глутатіон-S-трансферазної активності в мікросомній та постмікросомній фракціях при регенерації печінки, викликаній частковою гепатектомією.
Показники ензиматичної активності досліджували в регенеруючій тканині печінки мишей дикого типу C57BL/6J і трансгенних тварин Lrat-/- (миші, позбавлені ретинілефірів у печінці внаслідок нокауту гена ензиму лецитин:ретинол-ацилтрансферази (LRAT, 2.3.1.135)) через 12, 24, 48, 72 та 168 год після часткової гепатектомії. Активність системи цитохрому Р-450 оцінювали за швидкістю деметилювання диметиланіліну (N-деметилазна активність) та гідроксилювання аніліну (п-гідроксилазна активність) за кількістю утвореного формальдегіду і п-амінофенолу, що визначали з урахуванням коефіцієнтів молярного поглинання 1,5 мМ-1?см-1 та 13,3 мМ-1?см-1 та виражали в нмоль/хв/мг протеїну. Активність GST реєстрували шляхом ензиматичного утворення глутатіон-S-2,4-динітробензолу та виражали в мкмоль продукту за 1 хв на 1 мг протеїну.
Результати проведених досліджень показали, що початкові етапи регенерації печінки (12 та 24 год), викликані частковою гепатектомією, супроводжуються зниженням п-гідроксилазної і N-деметилазної активностей цитохрому Р-450 та GST-активності в мікросомній та постмікросомній фракціях клітин печінки мишей C57BL/6J. По мірі відновлення тканини печінки спостерігається поступове підвищення гідроксилазної активності цитохрому Р-450 з досягненням вихідних величин на 7 добу експерименту. Аналогічна тенденція прослідковувалась у випадку активності GST, показники якої не лише досягали вихідних величин (0 год), але й перевищували їх у 2 та 1,4 рази на 3 та 7 доби відповідно.
Водночас відсутність ретинілефірів у регенеруючій тканині печінки нокаутних тварин поглиблювала тенденцію до зниження досліджуваних ензиматичних активностей. Впродовж усього експерименту рівень п-гідроксилазної та N-деметилазної активностей цитохрому Р-450 в печінці мишей Lrat-/- залишався нижчим в 1,6 рази порівняно з показниками тварин C57BL/6J та не досягав значень 0 год. Водночас в мікросомній та постмікросомній фракціях печінки нокаутів в період 12 та 24 год спостерігалося вірогідне зниження глутатіонтрансферазної активності, показники якої лише на 7 добу експерименту досягали вихідних величин.
Отже, відсутність запасів ретиноїдів супроводжується зниженням ензиматичної активності глутатіонтрансферази на фоні пригнічення гідроксилазної активності цитохрому Р-450 на початкових етапах регенерації печінки, викликаної частковою гепатектомією.
УДК: 611.018.5.013.8:612.112.3.014.43
О.К. ГУЛЕВСЬКИЙ, Ю.С. ВЕСЕЛОВСЬКА, Н.М. МОІСЄЄВА, О.Л. ГОРІНА
ВПЛИВ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНОЇ ФРАКЦІЇ КОРДОВОЇ КРОВІ (до 5 кДа) НА ПОКАЗНИКИ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ ДЕКОНСЕРВОВАНИХ НЕЙТРОФІЛІВ
Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків;
Сьогодні у клінічній практиці трансфузія лейкоцитів є ефективним засобом лікування пацієнтів з гематологічними захворюваннями різного генезу. У зв'язку з цим вдосконалення методів зберігання лейкоцитів при низьких температурах, а також пошук способів відновлення їх функціональної активності перед трансфузією є актуальними. Раніше нами було показано, що використання реабілітаційного середовища, яке містить низькомолекулярну фракцію кордової крові (ФКК) корів (до 5 кДа), дозволяє підвищити показники фагоцитарної активності нейтрофілів, кріоконсервованих з 7,5 % диметилсульфоксиду (ДМСО). Проте у процесі кріоконсервування лейкоконцентрату з ДМСО відбувалося зменшення кількості життєздатних лейкоцитів до 69%, зумовлене втратою клітин гранулоцитарного ряду.
Мета роботи: дослідити вплив ФКК в складі реабілітаційного середовища на фагоцитарну активність нейтрофілів, кріоконсервованих під захистом диметилацетаміду (ДМАц), який є більш ефективним кріопротектором для гранулоцитів.
Лейкоконцентрат отримували з донорської крові людини методом седиментації еритроцитів декстраном. Кріоконсервування лейкоконцентрату проводили під захистом 5% ДМАц. Життєздатність клітин оцінювали методом забарвлення трипановим синім. Для оцінки фагоцитарної активності нейтрофілів досліджували їх поглинальну та переварюючу активність, а також індекс завершеності фагоцитозу. Виділення фракції з компонентами молекулярної маси до 5 кДа з кордової крові проводили методом ультрафільтрації. Ультрафільтрат ліофілізували і зберігали при -80°С. ФКК в середовище інкубації додавали в кількості 0,15 мг/мл.
Результати досліджень показали, що після кріоконсервування з 5% ДМАц зберігається до 79,96 ± 1,75% життєздатних лейкоцитів. Використання ФКК в складі реабілітаційного середовища надає стимулюючий ефект на знижені показники фагоцитарної активності деконсервованих нейтрофілів лейкоконцентрату. Так, їх поглинальна активність після 45 хв інкубації в середовищі, що містить ФКК, збільшувалася в 1,6 рази у порівнянні з контролем. Відзначено також підвищення до значень свіжовиділених клітин індексу завершеності фагоцитозу, який є підсумковим показником, що характеризує всі попередні етапи процесу фагоцитозу.
Показано, що використання 5% ДМАц в якості кріопротектору дозволяє зберегти до 80% життєздатних лейкоцитів. Встановлено, що ФКК в концентрації 0,15 мг/мл в середовищі інкубації стимулює поглинальну і переварюючу активність деконсервованих нейтрофілів.
УДК 618.12-022.2.; 618.177
О.Р. ВИДЖАК 1, Л.Ф. ЯКОВЕНКО 1, О.В. РОМАЩЕНКО 2, Л.М. КАПУСТЯН 1, М.О. ЩЕРБАК2, ,М.В. МАКАРЕНКО 3, Д.А. ГОВСЕЄВ 3, Л.Л. СИДОРИК 1
АНТИ-GroEL АНТИТІЛА У ЖІНОК ІЗ ПОРУШЕННЯМИ РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ НА ТЛІ ХРОНІЧНИХ ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ОРГАНІВ МАЛОГО ТАЗУ
1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України;
2ДУ “Інститут урології АМН України”;
3Пологовий будинок №5 Солом’янського району, Київ;
Вступ. Білки родини Hsp60 є висококонсервативними, антитіла до Hsp60 здатні перехресно реагувати з Hsp60 про- та еукаріотів. Антитіла до хламідійного Hsp60 асоціюються з високим ризиком розвитку репродуктивних ускладнень.
Метою даної роботи було порівняльне дослідження рівнів антитіл до GroEl E.coli (гомолог Hsp60 людини та Hsp60 Chlamydia trachomatis) у жінок із порушеннями репродуктивної функції внаслідок хронічних запальних захворювань органів малого тазу та породіль, а також пошук потенційних спільних епітопів між GroEL Escherichia coli, Hsp60 Chlamydia trachomatis та Hsp60 людини in silico.
Матеріали та методи досліджень. Обстежено 65 жінок віком від 18 до 45 років із ХЗЗОМТ. Контрольну групу склали 109 жінок-породіль співставних за віком. Рівень анти-GroEl АТ визначали методом ELISA. Отримання та очищення рекомбінантного білка GroEl E.coli проводили за розробленою методикою.
Амінокислотні послідовністі GroEL Escherichia coli, Hsp60 Chlamydia trachomatis та Hsp60 людини отримано з бази даних програми BLAST. Визначення гомології амінокислотних послідовностейі проводили у програмі CLUSTALW. Для передбачення можливих спільних лінійних епітопів використано домени http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl, http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py та http://tools.immuneepitope.org/.
Результати. Антитілопозитивні сироватки виявлено у 33,3% жінок із ХЗЗОМТ, 57,7% жінок із трубним безпліддям, 66,7% жінок із невиношуванням вагітності та 3,7% породіль.
Методами біоінформатики показано наявність спільних епітопів між GroEL Escherichia coli, Hsp60 Chlamydia trachomatis та Hsp60 людини, що дозволяє нам використовувати GroEL як антиген для ELISA.
Висновки. Підвищений рівень антитіл до GroEl може бути прогностичним критерієм ризику розвитку репродуктивних ускладнень у жінок із ХЗЗОМТ (трубне безпліддя, невиношування вагітності).
УДК [612.66+616-092.19]:577.15
І. С. ГЛОНЯГІНА, О. А. БЕРЕЖНА
АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ КАТАБОЛІЗМУ ЕНДОГЕННИХ АЛЬДЕГІДІВ У ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ЩУРІВ ПУБЕРТАТНОГО ВІКУ ПРИ СТРЕСІ
ДУ "Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків НАМН Україна", Харків;
Вступ. На етапі статевого дозрівання підвищується чутливість організму до стресу, що зумовлює високий рівень захворювань неврозами у підлітків. Згідно з існуючим уявленням, центральною і неспецифічною ланкою стрессорного пошкодження мозку є стимуляція в ньому процесів вільнорадикального окислення, наслідком якого стає накопичення в ньому цитотоксичних карбонільних продуктів метаболізму до числа яких відносяться альдегіди. У клітинах мозку є ферментативна система утилізації ендогенних альдегідів, компонентами якої є альдегіддегідрогенази і альдокеторедуктази. Між активністю цих ензимів і стійкістю клітин до вільнорадикального пошкодження виявлено тісний взаємозв'язок. Разом з тим, до теперішнього часу все ще відсутні уявлення про участь даних ферментів в антистресовому захисті організму, а також їх значення у підвищенні чутливості мозку до шкідливої дії стресу на етапі статевого дозрівання. З огляду на це, метою роботи стало вивчення особливостей модуляції активності ферментів, що каталізують окислювально-відновні перетворення ендогенних альдегідів в головному мозку щурів пубертатного віку при іммобілізаційному стресі.
Методи. Робота виконана на 57 щурах самцях лінії Вістар 1,5 - (ранній пубертат), 2 - (пізній пубертат) і 12-місячного віку (дорослі статевозрілі), яких в свою чергу підрозділяли на інтактних тварин і щурів, підданих іммобілізаційному стресу. В постмітохондріальній фракції півкуль головного мозку визначали активність NAD-залежної альдегіддегідрогенази, NADH-альдегідредуктази і альдозоредуктази.
Результати. Дослідження показали, що в мозку дорослих щурів при стресі не відбувається істотної модуляції активності досліджених ензимів. У той же час у тварин пубертатного віку виникає виражене підвищення активності альдегіддегідрогенази. На цьому тлі у 1,5-місячних іммобілізованих щурів відбувається альдегідредуктазной активності, хоча альдозоредуктазна активність у них підтримується на вихідному рівні.
Висновки. Таким чином, в мозку щурів пубертатного віку при іммобілізаційному стресі, формуються умови для забезпечення ефективної утилізації ендогенних альдегідів в обмінних шляхах, пов’язаних з їх окисно-відновними перетвореннями. Домінуюче значення при цьому, особливо у щурів 1,5-місячного віку, набуває шлях катаболізму, пов’язаний з їх окисленням в альдегіддегідрогеназної реакції. Разом з тим, слід мати на увазі, що в мозку щурів при стресі в умовах in vitro, можуть формуватися передумови для обмеження ефективності утилізації ендогенних альдегідів в окисно-відновних реакціях, з причини зміни регуляторних властивостей даних ензимів на етапі статевого дозрівання, як наслідок зміни її ізоферментного спектра. Вивчення даного питання стане предметом наших подальших досліджень.
УДК 577.352.38:577.64
Л. Л. ГНАТИШИНА, Г. І. ФАЛЬФУШИНСЬКА, О.Б. СТОЛЯР
Ідентифікація Ксеномодуляторів естрогенної активності водного середовища за молекулярними характеристиками двостулкового молюска
Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка, Тернопіль;
Новітні біоризики водного середовища визначаються комплексним характером забруднення та неефективністю традиційних методів очистки, хімічного аналізу та прогнозу дії та проявляються, зокрема, у ендокринних розладах. Двостулкові молюски є визнаними індикативними організмами у зв’язку із здатністю концентрувати речовини водного середовища. Ймовірна можливість екстраполяції результатів їх дослідження для оцінки стану хребетних тварин приваблює із етичних міркувань. Тому метою нашого дослідження стало з’ясувати стан стрес-респонсивних систем Anodonta anatina (Unionidae) за впливу пошкоджуючих чинників природного та модельного середовища.
Молюсків із чистої (І) та хронічно забрудненої (Б) місцевостей порівнювали за впливу іонів міді (10 мкг/л), цинку (150 мкг/л), кадмію (15 мкг/л), кобальту (50 мкг/л) та кобальт-вмісного наноматеріалу на основі вінілпіролідону (Со-НМ, 50 мкг Со/л), а також тетразинового (Аполло, 10 мкг/л) та тіокарбаматного (Татту, 91 мкг/л) пестицидів водного середовища протягом 14 діб. Аналізували вміст вітелогенін-подібного білку (Втг) у гонадах та гемолімфі особин чоловічої статі, функціональну активність білків металотіонеїнів (МТ), як метал-депонувальну (МТ-Ме), так і потенційну антиоксидантну (МТ-SH), системи антиоксидантного захисту, монооксигеназного окиснення (ЕРОД) у тканині травної залози; оцінювали рівень ураження за ознаками гено- та цитотоксичності в гемолімфі.
Молюски із водойми Б не мали істотних відмінностей за рівнем фрагментованої ДНК та стабільністю лізосомальних мембран від групи І. Проте у них були вищими вміст Втг у гонадах (удвічі), що вказує на вплив ксеноестрогенів у природній водоймі, та активність каспази-3, вміст МТ-Ме і МТ-SH. За допомогою побудови класифікаційного дерева (CART) , було доведено, що серед всіх характеристик молюсків саме рівень Втг є визначальним показником для розрізнення груп І та Б. Встановлено типові ознаки впливу кожного чинника (прооксидантний вплив, індукція МТ тощо). Рівень впливу у загальному оцінений як субтоксичний за часом стабільності лізосомальних мембран, окрім дії Со. Кожний чинник, за виключенням Со-НМ, активував вітелогенез, особливо у групі І, та посилював ознаки генотоксичності, а саме у групі Б. Багатофакторним аналізом доведено, що саме приналежність до певної популяції, І чи Б, а не природа діючого чинника визначали характер відповіді стрес-респонсивних систем молюска. Доведено переваги молекулярних систем депонування металів (МТ-Ме) у молюсків групи І та детоксикації органічних ксенобіотиків (ЕРОД) у групі Б, які, очевидно сформувались філогенетично.
Робота виконана за підтримки МОНмолодьспорт (№118Б, М/25-2011), НАНУ (№34-10), Держінформнауки (№М/13-2009 ) та ДФФД (Ф29/321-2009, № Ф32/202-2011).
УДК: 577:616.8:678.746.4-634.85-612.176:611
А.Р. ГНАТУШ1, В.Р. ДРЕЛЬ1, Н.О. ГАНАЙ2, А.Я. ЯЛАНЕЦЬКИЙ2, В.І. МІЗІН3, Н.О. СИБІРНА1
ЗАХИСНИЙ ЕФЕКТ ПРИРОДНИХ КОМПЛЕКСІВ ПОЛІФЕНОЛІВ ВИНОГРАДУ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ДІАБЕТИЧНИХ УСКЛАДНЕНЬ У ТКАНИНАХ ЩУРІВ ІЗ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ІНДУКОВАНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ
1Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів;
2Національний інститут винограду та вина “Магарач”, Ялта, АР Крим; 3Кримський державний гуманітарний університет, Ялта, АР Крим
Основним діагностичним індексом виникнення цукрового діабету є гіперглікемія. Вона сприяє утворенню вільних радикалів (ВР), зокрема пероксинітриту - оксиданту, який спричиняє нітрозилювання білків, перекисне окиснення ліпідів, розриви ДНК, зміни у шляхах передачі клітинних сигналів, наслідками яких є “діабетична стопа”, сліпота, ниркова недостатність, інфаркти, інсульти. Ушкодження, зумовлені вільними радикалами, можуть призводити до активації різних захисних механізмів, серед яких активація PARP-1 посідає провідне місце. За інтенсифікації утворення ВР відбувається процес активації роботи антиоксидантної системи. Поліфенольні комплекси, що у достатній кількості є у винограді, можуть відігравати важливу роль у антиоксидантному захисті через ензиммодулюючий, хелатуючий та скавенджерний ефекти.
Метою роботи було дослідження впливу препарату природних поліфенольних комплексів винограду на зміну активності ферментативної антиоксидантної системи та процеси нітрування і полі-ADPрибозилювання білків спинного мозку, дорсальних гангліїв (ДСМГ), сідничного нерву, нирки та ретини, як ранніх маркерів розвитку діабетичних ускладнень.
За умов споживання препарату поліфенольних комплексів винограду щурами розведеного у питній воді у дозі, що відповідає 23,5 мг/кг маси тіла/день, відповідно до пропорції 300 мл вина/70 кг маси тіла/день (з моніторингом та корекцією об’єму кожної доби), протягом двох тижнів перед та протягом місяця після індукції діабету маса щурів зросла на 36% і 18% порівняно із масою тварин перед початком експерименту. Збільшення вмісту нітротирозину у тканинах сідничних нервів, ДСМГ, спинного мозку, нирок і ретини на 48%, 60%, 40%, 52% і 38% відповідно, а також рівня полі (ADP)- рибозильованих протеїнів нормалізувалось до значень контролю за умов споживання препарату поліфенолів. Активність ензимів антиоксидантного захисту повністю, або частково відновлювалася до значень контролю. Кількість кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів знижувалась до рівня контролю.
Отже, природні поліфенольні комплекси винограду спричиняють значний антидіабетичний ефект як на рівні цілого організму, захищаючи його від зневоднення, так і шляхом підвищення активності ензимів антиоксидантного захист у тканинах нирки, ретини, периферичної нервової системи. Рівень нітротирозин-модифікованих і полі (ADP)- рибозильованих білків за споживання препарату сягає величини контрольних значень. Біохімічні механізми дії поліфенолів винограду є предметом наступних досліджень, проте препарати, отримані з винограду, можуть бути використаними при лікуванні ускладнень цукрового діабету і при створенні антидіабетичних ліків.
Роботу виконано за фінансової підтримки Західно-Українського Біометричного Дослідницького Центру (індивідуальний грант А. Р. Гнатуша на 2011–2012 рр.).
УДК:616-006.04:577.122:612.014
О.Л. ЄФАНОВА, М.Р. ХЕЦУРІАНІ, Ю.М. ЮЗЕФОВИЧ, О.В. ЖУРАВЕЛЬ, М.О. СОЛДАТКІНА
Отримання рекомбінантного бета-дефенсину-4 людини та дослідження його біологічної активності
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАНУ, Київ; pogrebnoy@onconet.kiev.ua
Вступ. Дефенсини належать до родини антимікробних пептидів з молекулярної вагою 4-6 kD, високим вмістом цистеїна та аргиніна та характерною третинною структурою, що стабілізована трьома дисульфідними містками. За структурними особливостями дефенсини віднесено до двох підродин – альфа- та бета-дефенсинів (human beta-defensins (hBDs)). hBDs є біологічно активними молекулами, які вододіють антимікробною та імуномодулюючою активностями, приймають участь у контролі росту клітин та загоєнні ран.
Ціллю роботи було отримати рекомбінантний бета-дефенсин-4 людини (hBD-4) шляхом клонування та експресії в бактеріальних клітинах та дослідити його біологічну активність.
Методи: Нами було застосовано методи молекулярної біології та генної інженерії, біохімічні методи (градієнтний ПААГ електрофорез, афінна та звортньофазова хроматографія), мікробіологічні методи, культура клітин та методи клітинної біології.
Результати: Ген, що кодує молекулу hBD-4, було клоновано з тотальної РНК клітин А431, які було інкубовано з 10 нг/мл ЛПС P. аeruginosa; кДНК hBD-4 було ампліфіковано з використанням специфічних праймерів: hBD-4-F: 5`-GTGTTGGATCCgaatttgaattggacagaat-3`; hBD-4-R: 5`-tcttggaattctcagggttttgtacgattcagta-3. ПЛР продукт було клоновано в вектор pGEX-2T, після чого отриманий рекомбінантний вектор було використано для трансформації E.coli BL21DE3. Після селекції було відібрано трансформовані колонії, що експресують злитий білок GST-hBD-4. Рекомбінантний пептид hBD-4 було виділено та очищено з лізату бактерій шляхом афінної хроматографії на Glu-сефарозі, розщеплення хімерного білка тромбіном та зворотньофазової хроматографії на колонці Sep-Pack C18. Всі етапи очистки hBD-4 контролювали шляхом SDS-електрофорезу в градієнтному 7–22% ПААГ.
Нами було досліджено біологічну активність рекомбінантного hBD-4. Згідно до даних антимікробного теста Hultmark., пептид був активним проти Pseudomonas aeruginosa в мікромолярних концентраціях. Вплив рекомбінантного hBD-4 на культивовані пухлинні клітини людини лінії A431 було досліджено методом прямого підрахунку клітин та встановлено, що hBD-4 впливає на параметри росту клітин А431 концентраційно-залежним шляхом, властивим для бета-дефенсинів: hBD-4 стимулював ріст клітин у концентраціях, нижчих за 1 нM, пригнічував ріст клітин в концентраційному діапазоні між 10 нM та 1 мкM і призводив до загибелі клітин в концентраціях, що перевищували 1 мкM. Крім того, нами було проаналізовано вплив рекомбінантного hBD-4 на міграційні властивості клітин аденокарциноми легені лінії A549 та встановлено, що 1 нM hBD-4 значно підсилює рухливість клітин у скретч-тесті.
Висновки: Нами клоновано та експресовано в бактеріях у вигляді злитого білка рекомбінантний бета-дефенсин-4 людини, розроблено схему його очистки та досліджено біологічну активність. Пептид є активним проти P.aeruginosa в мікромолярних концентрацїях, концентраційно-залежним шляхом впливає на ріст культивованих пухлинних клітин людини та стимулює їх рухливість в наномолярних концентраціях.
УДК 57.042; 599.32; 504.5; 577.125.33
C. В. ЗАДИРА, В. А. КОВАЛЬОВА, Д. В. ЛУКАШОВ
ПРОДУКТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У КЛІТИНАХ ПЕЧІНКИ МИШОПОДІБНИХ ГРИЗУНІВ В УМОВАХ ТЕХНОГЕННОГО ЗАБРУДНЕННЯ ДОВКІЛЛЯ
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦ “Інститут біології”;
Вступ. Процеси перекисного окиснення необхідні для нормального функціонування біохімічних і фізіологічних систем живих організмів; у нормі постійно перебігають у всіх клітинах (зокрема, печінки). Відомо, що одним з проявів токсичного впливу важких металів є активізація процесу перекисного окиснення ліпідів клітинних мембран. Печінка виступає одним з основних органів детоксикації. Дослідження процесів перекисного окиснення ліпідів модельних видів мишоподібних гризунів сьогодення може дати цінну інформацію щодо особливості протікання патологічних процесів в організмі ссавців в умовах антропогенного забруднення довкілля.
Матеріали та методи. Досліджували особин з природних популяцій мишоподібних гризунів – рудої нориці (Myodes glareolus) та жовтогорлої миші (Apodemus flavicollis), що мешкають на територіях з різним ступенем антропогенного забруднення: Канівського природного заповідника (Черкаська обл.); Національного природного парку "Голосіївський" (м. Київ); район Трипільської ТЕС (електростанція переважно працює на вугіллі). Вміст важких металів у верхньому 5 см шарі ґрунту та печінці тварин визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії. Досліджено вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у гомогенаті печінки – дієнових кон’югатів, малонового діальдегіду та шифових основ. Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики.
Результати. На відстані 500 м на південний схід від Трипільської ТЕС виявлено підвищений вміст у ґрунтах рухомих форм Pb, Cd, Cr, Ni та Co, що значно (у 3-5 разів) перевищує рівні, характерні для території природного заповідника. У ґрунтах НПП "Голосіївський" відмічено підвищений вміст Pb. Проте, у жодному випадку перевищення рівнів ГДК для ґрунтів не встановлено. У печінці мишей зафіксовано збільшення вмісту Cu, Zn та Mn в районі впливу Трипільскої ТЕС. Підвищення вмісту важких металів у останніх двох районах скоріше за все зумовлено процесами атмосферного переносу та випадіння забруднювачів.
У печінці рудої нориці та жовтогорлої миші відмічено відмінності процесів накопичення продуктів перекисного окиснення ліпідів. На відміну від природно-заповідної території, в районі Трипільської ТЕС зафіксовані найвищі показники вмісту продуктів окиснення ліпідів – дієнових кон’югатів (у 5 разів у рудої нориці та 6 разів у жовтогорлої миші), малонового діальдегіду (у 8 та 4 разів відповідно) та шифових основ (в 2 та 1,5 разів). Руда нориця за спектром живлення є яскравим поліфагом на відміну від жовтогорлої миші, яка є стенофагом. Тому високий вміст малонового діальдегіду у печінці мишоподібних гризунів, можна припустити, тісно пов'язаний з харчовим надходженням важких металів, що призводить до ураження мембран клітин печінки.
Висновки. У печінці рудої нориці та жовтогорлої миші в районі впливу Трипільської ТЕС спостерігається значне накопичення продуктів перекисного окиснення ліпідів у порівнянні із популяціями природно-заповідних територій. Таким чином, в умовах збільшення вмісту важких металів у довкіллі спостерігаються ознаки ураження мембран клітин печінки особин з природних популяцій мишоподібних гризунів.
УДК 611.018.46:615.014.41:547.42
В.С. ЗАЙКОВ, Ю.А. ПЕТРЕНКО, А.Ю. ПЕТРЕНКО
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В АЛЬГИНАТНЫХ СФЕРИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЯХ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВКЛЮЧЕНИЕМ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков;
Инкапсуляция мезенхимальных стромальных клеток (МСК) а альгинатные сферические носители является одним из перспективных направлений тканевой инженерии. Альгинат обладает слабыми адгезивными свойствами, что обуславливает необходимость модификации носителей на его основе, путем введения в состав адгезивных веществ.
В данной работе изучалось влияние включения плазмы крови человека в состав альгинатных сферических носителей (АСН), на жизнеспособность, метаболическую активность и способность к адипогенной дифференцировке заключенных в них МСК.
Для инкапсуляции МСК смешивали с 1,2% альгината натрия, после чего покапельно вносили в раствор CaCl2 (группа АСН). Паралельно в раствор альгината вносили 22,5% плазмы (группа АСН-П). Для определения эффективной концентрации клеток внутри носителя, в состав АСН заключали клетки с контрецацией 1, 1.5 и 2*106 на 1 мл геля. Жизнеспособность и метаболическую активность клеток в составе микросфер оценивали с помощью окрашивания редокс-индикатором МТТ на 1, 14 и 28 сутки после инкапсуляции. Адипогенную диференцировку проводили в среде ?-МЕМ, содержащей 0.5 мМ 3-изобутил-1-метил-ксантина, 1 мкМ декстаметазона, 10мкг/мл инсулина и 100 мкМ индометацина в течении 28 суток. Оценку адипогенной дифференцировки проводили с использованием красителей Nile Red и Oil Red. В качестве контроля на спонтанную диференцировку испрользовали инкапсулированные клетки, кулитивируемые в среде экспансии.
Было получено, что при длительном культиворованиии МСК в составе АСН, клетки не распластывались, сохраняя сферическую форму. В тоже время в АСН-П, на 2-3 сутки начинали появляться клетки с фибробластоподобной морфологией, при этом наибольший эффект наблюдался при инкапсуляции клеток в концентрации 1.5*106/мл. Проведение МТТ теста показало, что на протяжении 28 суток в группе АСН наблюдается 15% падение жизнеспособности и 50% метаболической активности. В группе АСН-П падение жизнеспособности составило по результатам МТТ-теста составило 5%. При этом при инкапсуляции клеток в концентрации 1.5*106/мл уровень метаболической активности повышался на 26%. Через 28 суток адипогенной дифференцировки в МСК, инкапсулированных в альгинатные носители, наблюдалось накопление внутриклеточных липидов, которые позитивно окрашивались красителями Nile Red и Oil Red. Спонтанная дифференцировка не была обнаружена.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования плазмы крови человека в качестве модификатора альгинатных сферических носителей. Клетки, инкапсулированные в такие носители обладают высокими показателями жизнеспособности и метаболической активности, а также способностью к диференцировке в адипогенном направлении. В отличие от клеток, инкапсулированных в не модифицированный альгинатный носитель, клетки внутри модифицированного носителя способны приобретать фибробластоподобную форму.
УДК 612.111:577.21
О.П. КАНЮКА, Н.О. СИБІРНА
ПРОЛІФЕРАЦІЯ ТА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ КЛІТИН ЕРИТРОЇДНОГО РЯДУ ЗА УМОВ СПРЯМОВАНОЇ ІНАКТИВАЦІЇ ГЕНА PTTG
Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів;
Еритропоез – генетично детермінований процес, який забезпечується шляхом проліферації і диференціації еритроїдних попередників у кровотворних органах тварин. У попередніх дослідженнях було встановлено, що ген pttg є необхідним для проліферації та міграції стовбурових клітин кісткового мозку. Цей ген кодує білок секурин, який відіграє важливу роль у підтриманні сестринських хроматид в асоційованому стані у S-фазі клітинного циклу. Завдяки цьому ген pttg бере участь у регуляцiї таких ключових для клiтини подiй, як мiтоз, репарацiя ДНК і апоптоз. Однак на даний момент відсутні дані про вплив цього гена на проліферацію клітин еритроїдного ростка кісткового мозку.
Для досліджень використовували мишей лінії BL6/C57 дикого типу (pttg–WT) та мишей з нокаутом гена pttg (pttg–KO). Визначення проліферативної активності клітин еритроїдного ряду проводили із застосуванням імуноферментного аналізу, що дозволяє кількісно оцінити рівень включення в проліферуючі клітини аналога тимідину - 5-бром-2'-дезоксиуридину (BrdU). Піддослідним тваринам попередньо вводили BrdU фірми “Millipore” (США) з розрахунку 50 мкг/г маси тіла внутрішньочеревно. Через 12 годин тварин декапітували, виділяли стегнові кістки для подальшої аспірації кісткового мозку. Клітини еритроїдного ряду отримували шляхом фракціонування суспензії клітин кісткового мозку у тришаровому градієнті густини фікол–тріомбрасту. Мазки клітин кісткового мозку фарбували з використанням методики комбінованого забарвлення за Папенгеймом.
Було встановлено, що за умов нокауту гена pttg відбувається підвищення проліферативної активності еритроїдних попередників у S-фазі мітотичного циклу на 23,8% порівняно із аналогічними показниками у мишей дикого типу. Дослідження морфологічного складу кісткового мозку виявили, що число еритробластів, пронормоцитів та базофільних нормоцитів зростає за умов нокауту гена pttg. При цьому кількість поліхроматофільних і оксифільних нормоцитів була достовірно нижчою на 24,0% і 31,17% відповідно.
Таким чином, вивчення клітинного складу кісткового мозку мишей за умов нокауту гена pttg свідчить про виражений дисбаланс утворення, дозрівання та диференціювання клітин еритроїдного ряду.
УДК 576.342:612.822
L.A. KASATKINA, T.A. BORISOVA
MECHANISMS OF GLUTAMATE RELEASE FROM BLOOD PLATELETS
Palladin Institute of Biochemistry, NAS of Ukraine;
Background: Platelets contain neuronal Na+-dependent glutamate transporters in the plasma membrane, vesicular glutamate transporters in secretory granules, which use the proton electrochemical gradient as a driving force. The aim of this study was to assess whether non-exocytotic glutamate release, i.e. unstimulated release, glutamate transporter reversal and heteroexchange, takes place in blood platelets, similar to that occurred in brain nerve terminals.
Methodology/Principal Findings: We showed the absence of unstimulated glutamate release from platelets, even in the presence of non-transportable inhibitor of glutamate transporters DL-TBOA (DL-threo-?-benzyloxyaspartate). We demonstrated with Na+-sensitive fluorescent dye that membrane depolarization by high-KCl did not accompanied by Na+ influx in platelets. Using glutamate dehydrogenase assay and radiolabeled L-[14C]glutamate we revealed that high-KCl depolarization of the plasma membrane in Ca2+-free medium did not cause glutamate release from platelets. Transportable inhibitor of glutamate transporters DL-THA (DL-threo-?-hydroxyaspartate) did not evoke glutamate efflux from platelets by means of heteroexchange. The application of the inhibitor of H+-ATPase V-type bafilomycine A1 and the protonophore FCCP, which dissipate the proton gradient of platelet secretory granules and can enhance the cytosol of platelets with granule`s glutamate, did not provoke glutamate release from platelets. Release of endogenous glutamate from platelets was not registered during inhibition of cytoplasmic enzyme glutamine synthetase by methionine sulfoximine in above experiments. In contrast, exocytotic release of glutamate from secretory granules in response to thrombin stimulation was not prevented by bafilomycine A1 or FCCP, with subsequent application of DL-THA (to provoke heteroexchange) or high-KCl (depolarization of plasma membrane).
Conclusions/Significance: Unstimulated release of glutamate, glutamate transporter reversal and heteroexchange were not inherent to blood platelets. It seems that vesicular glutamate transporters of platelets effectively work in inward direction only, whereas their reverse function is rather ambiguous and/or ?pH (unlike ??) is not important for storage of glutamate in platelet secretory granules. Glutamate release from platelets proceeds by exocytosis (degranulation) only.
Key words: glutamate, Na+-dependent transporters, transporter reversal, blood platelets, brain nerve terminals
УДК 616.39-053.6:577.11+612.349.8
Д.К. КУЛЄШОВА
ПОКАЗНИКИ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕННЯ У ЮНАКІВ-ПІДЛІТКІВ З ОЖИРІННЯМ, УСКЛАДНЕНИМ ІНСУЛІНОРЕЗИСТЕНТНІСТЮ
ДУ «Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків НАМН України», Харків;
У підлітковому віці широке розповсюдження набуває нейроендокринне ожиріння. У зрілому віці воно визначає виникнення таких грізних захворювань, як атеросклероз, гіпертонічна хвороба, цукровий діабет тощо. У цьому зв’язку розробка нових методів профілактики та лікування ожиріння у підлітковому віці набуває характер завдань державного значення. Особливо важливим для вирішення цих завдань слід вважати вивчення молекулярних механізмів формування нейроендокринного ожиріння. Згідно існуючим уявленням особливу роль у його розвитку у дорослих відіграє підсилення процесів вільнорадикального окислення в організмі. Менш відомо про стан даних процесів в організмі хворих підлітків з нейроендокринним ожирінням, яке часто супроводжується формуванням інсулінорезістентності. Проте по теперішній час відсутні відомості про стан вільнорадикальних процесів в організмі підлітків з нейроендокринним ожирінням, ускладненим інсулінорезистентністю. Зважаючи на це, ціллю даної роботи було визначення вмісту карбонілірованих білків (КБ) та швидкості індукованих вільнорадикальних процесів у крові підлітків з ожирінням, ускладненим інсулінорезистентністю.
Дослідження виконане у підлітків 16-18 років (пізний пубертат). Усіх обстежуваних підрозділяли на 3 підгрупи: 1 - контрольна група (здорові); 2 – хворі з нейроендокринним ожирінням; 3 – хворі з нейроендокринним ожирінням, ускладненим інсулінорезистентністю. В сироватці крові досліджуваних визначали вміст КБ, а також швидкість індукованого відновлюваним залізом перекисного окислення ліпідів (ПОЛ).
Проведені дослідження показали, що у підлітків з неускладненим ожирінням відбувається зменшення на 53% вмісту КБ та виникнення вираженої тенденції до зниження швидкості індукованого ПОЛ у крові у порівнянні з їх величинами у контрольних досліджуваних. У підлітків з ожирінням, ускладненим інсулінорезистентністю, вміст КБ не відрізняється, а швидкість індукованого ПОЛ зростає на 71% у порівнянні з цими величинами у підлітків з неускладненим ожирінням.
Отримані дані свідчать про те, що розвиток нейроендокринного ожиріння у пізньому пубертаті супроводжується змінами у стані вільнорадикального окислення в організмі підлітків, про що свідчать зниження рівня КБ у крові. Проте причини виникнення цього зрушення у підлітків з різними формами ожиріння не однакові. При неускладненому ожирінні особливу роль у його виникненні набуває підвищення антиоксидантної активності крові (ААК) і, як внаслідок того, зменшення швидкості утворення КБ. У підлітків з ожирінням, ускладненим інсулінорезистентністю, зменшення змісту КБ у крові відбувається в умовах потужності ААК. Можна припустити про те, що зменшення рівня КБ обумовлено в них підвищенням швидкості катаболізму карбонільних продуктів вільнорадикального окислення.
УДК 577.151.04+577.151.643
О. С. КУЛІНІЧ, А. О.УШПІК, О. О. ДЬОМШИНА, Н. І. ШТЕМЕНКО
?-ГЛУТАМІЛТРАНСПЕПТИДАЗА ТА ВІДНОВЛЕНИЙ ГЛУТАТІОН ПЛАЗМИ КРОВІ І ПЕЧІНКИ ЩУРІВ У МОДЕЛІ ПУХЛИННОГО РОСТУ
Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара, кафедра біофізики та біохімії, Дніпропетровськ;
Гамма-глутамілтранспептідаза (GGTP) - мембранозв'язаний білок, який каталізує реакцію відщеплення глутамільного залишку від молекули глутатіону. При цьому, в нормі активність в крові незначна, у зв'язку з чим, визначення активності GGTP саме в крові має істотне значення для діагностики стану печінки та гепатобіліарної системи [Зильва 1988, Barcelo 2006, Shimada 1982, Zhang 2009].
Mетою роботи було визначення кількості глутатіону та активності гамаглутамілтранспептидази у плазмі крові та гомогенаті печінки щурів в моделі пухлинного росту та гальмування даного процесу системою Реній-Платина при різних способах введення.
Встановлено, що розвиток пухлини призводить до значного зниження кількості відновленого глутатіону з одночасним підвищенням активності GGTP як у печінці, так і в плазмі крові щурів. Застосування цисплатину призвело до підвищення кількості GSH в печінці у 2 рази, у плазмі у 3 рази, при цьому активність GGTP не змінилася порівняно із групою Т8. Отже, відбувається активізація захисної системи в умовах ксенобіотичного впливу. При введені наноліпосом навантажених дикарбоксилатним комплексом ренію (ІІІ) із ізобутиратним лігандом у цис-конформації у печінці кількість відновленого глутатіону підвищується порівняно із групою пухлиноносіїв, а активність GGTP підвищується у 4 рази, порівняно із інтактними тваринами, при цьому у плазмі активність на рівні норми. Отримані дані свідчать про незначну гостру гепатотоксичність комплексу, що супроводжується внутрішньопечінковою біліарною обструкцією (що підтверджується даними по активності лужної фосфатази у печінці – підвищення у 8 разів порівняно із інтактними тваринами), однак без ушкодження мембран клітин печінки.
Використання наноліпосом, навантажених системою Реній-Платина у співвідношені компонентів 4:1([Recisisobyt+cpt]nl 4:1), у якості агентів, що здатні інгібувати злоякісний ріст клітин, показало збільшення кількості відновленого глутатіону у печінці у 4 рази порівняно із групою тварин пухлиноносіїв і у 1,5 разів – із іншими дослідними групами. Тобто, в даних умовах відбувається активізація глутатіонової системи захисту печінки та прискорення утворення глутатіону, що використовується для захисту організму в цілому (підвищення кількості GSH в плазмі у 4 рази). Активність GGTP в печінці залишається підвищеною, при цьому в плазмі знижується до рівня норми порівняно із групами тварин пухлиноносіїв та яким вводили цисплатин. Таким чином, система Реній-Платина є ефективною протипухлинною системою (редукція пухлини на 99%), що забезпечує поступове відновлення рівноваги окисно-відновних процесів в цілому організмі.
УДК 616.37:547.466.6:577.156.6
В.А. МАКАРЧУК, Г.О. УШАКОВА
ВПЛИВ ПАТОЛОГІЇ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ЩУРІВ НА ВМІСТ ВІДНОВЛЕНОГО ГЛУТАТІОНУ ТА АКТИВНІСТЬ ГЛУТАТІОН-ЗАЛЕЖНИХ ФЕРМЕНТІВ У КРОВІ
ДУ «Інститут гастроентерології АМН України»; Дніпропетровський національний університет ім. О. Гончара, Дніпропетровськ;
Ключові слова: гострий та хронічний панкреатит, відновлений глутатіон, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза.
Метою дослідження була оцінка вмісту відновленого глутатіону (ВГ) та активності глутатіонпероксидази (ГПО) і глутатіонредуктази (ГР) в крові експериментальних щурів за умов розвитку гострого та хронічного панкреатиту (ГП та ХП).
Методи дослідження. Моделювання ГП та ХП у тварин здійснювалося шляхом хірургічної перев’язки головного панкреатичного протоку підшлункової залози (ПЗ) в хвостовому відділі органу (Benedikt J Page, 2000). В плазмі крові концентрацію ВГ визначали за методом Елмана, активність ГПО – за Olineseu, ГР – за Переслигіної. При статистичній обробці результатів використовували пакет програм SPSS 10.0 for Windows. Різниця вважалася достовірною при р<0,05, р<0,01, р<0,001.
Об’єктом дослідження були лабораторні щури-самці (вік–6 місяців, 190–200 г), розділені на наступні групи (по 6 тварин в кожній): псевдооперовані щури (контроль), I група – щури з ГП, II група - перехідна група між ГП та ХП і III група – щури з ХП (6-, 15- та 30-денне лігування протоку ПЗ відповідно).
Результати. Згідно отриманих даних, зниження концентрації ВГ у групі тварин з експериментальним ГП відбувалося в 1,2 рази до (1,97±0,06) ммоль/л (р<0,05), у перехідній групі – в 1,3 рази до (1,86±0,12) ммоль/л (р<0,05) та у щурів з ХП – 1,4 рази до (1,73±0,06) ммоль/л (р<0,05), у порівнянні з контролем (2,34±0,07) ммоль/л, що свідчило про виснаження компенсаторних можливостей глутатіонової ланки. У щурів I групи спостерігалося незначне зниження активності ГПО, у II групі тварин вона була вже на 15,6% нижчою за контрольний показник (202,4±5,32) мкмоль/л·хв і становила (170,85±9,87) мкмоль/л·хв (р<0,05), а в III групі дане зниження досягло 22,3% (157,36±8,54) мкмоль/л·хв (р<0,05). Слід відмітити, що між групою щурів з ГП та ХП різниця в активності ГПО була достовірною (р<0,05). Максимальне зниження активності іншого ферменту глутатіонової системи – ГР – відбулося також у групі тварин з ХП – на 21,0% з (6,38±0,54) нмоль/гHb·хв (псевдооперовані щури) до (5,04±0,35) нмоль/гHb·хв (р<0,05).
Висновки. Таким чином, представлені дані свідчать про суттєве пригнічення захисних механізмів в організмі експериментальних щурів при хронічній формі панкреатиту, виражене зниженням активності глутатіон-залежних ферментів на тлі низького вмісту ВГ.
УДК 598.278: 661.875
Р.Я. ІСКРА, І.Я. МАКСИМОВИЧ
МЕТАБОЛІЧНІ ПРОЦЕСИ В ОРГАНІЗМІ ВАГІТНИХ ЩУРІВ ЗА ДІЇ ЦИТРАТУ НАНОХРОМУ
Інститут біології тварин НААН, Львів;
Вступ. Значна перебудова життєдіяльності організму вагітних супроводжується біохімічними змінами метаболізму, зокрема, інтенсифікацією білкового, ліпідного і вуглеводного обміну. У зв’язку зі зростанням основного обміну і збільшенням споживання кисню в крові матері підвищується концентрація ненасичених жирних кислот, які є безпосереднім субстратом для перекисного окиснення ліпідів. Важливим регулятором процесів перекисного окиснення ліпідів і активності антиоксидантної системи в організмі у період вагітності є хром (Cr3+). Тому, метою досліджень було з’ясувати вплив цитрату нанохрому на метаболічні процеси, які відбуваються в організмі самок щурів під час вагітності.
Методи. Дослідження проведені на самках білих щурів лінії Вістар, масою 180-200 г, які були поділені на дві групи – контрольну і дослідну. Від початку спаровування самкам щурів дослідної групи до води, яку випоювали, додавали розчин цитрату нанохрому в дозі 10 мкг Cr3+/кг маси тіла, який був одержаний методом електроімпульсної нанотехнології. Через 20 діб після спаровування здійснювали декапітацію тварин з метою отримання крові для досліджень.
Результати. У результаті проведених досліджень встановлено, що за дії цитрату нанохрому знижується підвищений рівень глюкози в крові вагітних щурів на 22,0 %, що очевидно зумовлено кращим її надходженням до клітин крові. За цих умов в еритроцитах активується гліколітичний шлях окиснення глюкози, що підтверджується зростанням лактатдегідрогеназної активності на 16,7 % та пентозофосфатний шлях, що зумовлено підвищенням глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності на 38,3%. У процесі активації пентозофосфатного шляху генерується NADPH, який використовується для відновлення глутатіону у глутатіонредуктазній реакції. Це підтверджується підвищенням активності глутатіонредуктази на 13,0 % та вмісту відновленого глутатіону на 24,3 % у самок за дії нанохрому. У той же час, активність глутатіонпероксидази в крові дослідних тварин не змінюється, незважаючи на високий рівень внутрішньоклітинного відновленого глутатіону, який, очевидно, може бути використаний глутатіон-S-трансферазою, що можна розглядати як компенсаторну реакцію, спрямовану на нейтралізацію вторинних метаболітів кисню.
Крім цього, за дії цитрату нанохрому в крові вагітних самок збільшується вміст білка на 4,5 % та знижується активність аланінамінотрансферази на 3,5% і аспартатамінотрансферази на 12,6 %, що свідчить про позитивний вплив даної сполуки на білок синтезуючу функцію організму вагітних та зниження рівня вивільнення амінотрансфераз у кров’яне русло з тканин під впливом цитрату нанохрому.
Висновки. Таким чином, проведені експериментальні дослідження свідчать про інтенсифікацію білкового обміну, гліколітичного і пентозофосфатного шляху окиснення глюкози, активацію глутатіонового пулу в крові вагітних самок щурів за дії цитрату нанохрому в дозі 10 мкг Cr3+/кг маси тіла.
УДК 579.222:579.254.2
A.E. МАЛИНА
ГЕНЕТИЧНА ТРАНФОРМАЦІЯ PICHIA PASTORIS ДЛЯ ЕКСПРЕСІЇ ПОЛІАМІНОКСИДАЗИ
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ;
Pichia pastoris є однією з найбільш оптимальних систем експресії широкого спектру рекомбінантих білків, що зумовлено генетичними, фізіологічними та культуральними факторами: промотор, який забезпечує жорсткий контроль експресії чужорідних генів; здатність до посттрансляційних модифікацій, яка відсутня в бактеріальних системах експресії; простота, дешевизна та швидкість культивування в промислових масштабах.
Різноманітність і життєва важливість клітинних функцій поліамінів дозволяють розглядати спермідин і спермін у якості низькомолекулярних регуляторів клітинного метаболізму, причому зменшення концентрації поліамінів призводить до гальмування росту чи до гибелі клітин.
Поліаміноксидаза (РАО) – фермент, який каталізує реакцію з перетворенням N1-ацетилсперміну, кисню і води, на N1-ацетилспермідин, 3-амінопропанал і перекис водню.
Тому, метою досліджень було отримання РАО в лабораторних умовах для подальшого вивчення функцій амінів, таких як спермін та спермідин.
Для конститутивної експресії рекомбінантних білків в Pichia pastoris використовували вектор pGAPZ? A,B з GAP-промотором (повна і коротка версія), яким було трансформовано штам P. pastoris X-33 (дикого типу). Трансформацію проводили методом електопорації, після чого трансформовані клітини висівали на чашки Петрі із середовищем Yeast Extract Peptone Dextrose medium (YPD), яке містило 100 мкг/мл Zeocin.. Клітини культивували протягом 3 діб, отримані колонії були стійкими до зеоцину.
Якість трансформації аналізували методом RT-PCR, в наслідок чого було підтверджено позитивну трансформацію P.pastoris для обох версій вектора pGAPZ?. Експресію проводили на середовищі YPD протягом 5 діб. Кожні 24 год відбирали пробу для визначення специфічної активності поліаміноксидази (РАО). Аналіз експресії РАО проводили за допомогою SDS-гель-електрофорезу за Леммлі в денатуруючих умовах.
Було встановлено, що трансформована P. pastoris X-33 повнорозмірною версією вектора pGAPZ? експресує РАО, у той час коли клітини дріжджів, трансформовані короткою версією вектору pGAPZ? цільовий білок не синтезували.
Отже, для отримання РАО у промислових кількостях нами було підібрано оптимальну систему експресії цільового білка на основі дріжджів P. pastoris Х-33, трансформованих повнорозмірним вектором pGAPZ?.
Робота виконувалась в Лабораторії молекулярної біології, факультету біохімії, Палацького Університету м. Оломоуць, Чеська Республіка.
УДК 576.32/36; 57.085.23
С.В. МАЛИШЕВА 1,2, Г.В. БУДАШ 1,2, Д.І. БІЛЬКО 1
ПЛЮРІПОТЕНТНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОТРИМАНИХ ЗА ДОПОМОГОЮ СИСТЕМИ ТРАНСПОЗОНІВ ІНДУКОВАИХ ПЛЮРІПОТЕНТНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН МИШІ
1Національний університет Києво-Могилянська академія, Київ, Україна;
2Інститут нейрофізіології Кельнського університету, Кельн, Німеччина
Індуковані плюріпотентні стовбурові клітини вперше отримано із фібробластів миші шляхом ретровірусної трансдукції чотирьох транскрипційних факторів: Oct3/4, Sox2, Klf4 таc-Myc (Yamanaka, 2007). Інтродукція факторів плюріпотентності за допомогою системи мобільних генетичних елементів є принципово новим підходом, що має ряд переваг (Izsvak, 2010). Дана робота присвячена вивченню плюрипотентних характеристик лінії іПСК, отриманої за допомогою системи траснпозонів.
За допомогою системи транспозонів Sleeping beauty ембріональні фібробласти миші штаму с57Bl6/N репрограмовано в активно проліферуючі клони лінії, названої mTiPSCs (murine transposon-induced pluripotent stem cells). Отримані клони культивували на фідерному шарі з інактивованих фібробластів миші в присутності фактору LIF для підтримання їх у недиференційованому стані. Аналіз експресії генів на рівні транскриптів проводили за допомогою RT-PCR, на рівні білку – за допомогою флюоресцентно-мічених антитіл та FACS аналізу. Диференційний потенціал отриманої лінії вивчали у системі in vitro (Okada, 2010). У якості позитивного контролю обрано зареєстровані лінії мишиних ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) ?PIG44 та індукованих плюріпотентних стовбурових клітин (іПСК) AT25.
Усі колонієподібні структури, що почали з’являтись на 8-му добу репрограмування, мали лужнофосфотазну активніть. Рівень експресії SSEA-1, локалізованого на поверхні клітин маркера плюріпотентності, варіював від 59,60 % у клона 20 до 94 % у клона 17. У контрольних лініях АТ25 та ?PIG44 експресія цього маркера становила 91,5 та 93 %, відповідно. Експресію SSEA-1 не виявлено у вихідній лінії ембріональних фібробластівмиші (0,66 %). Для подальшого аналізу обрано три клони лінії mTiPSCs – клон 6, 7 та 9. У досліджуваних клонах спостерігали експресію на рівні мРНК транскриптів факторів Oct3/4 та Sox2, що містяться у репрограмуючій касеті. Разом з тим, за допомогою флюоресцентно мічених антитіл локалізовано експресію транскрипційного фактору Oct3/4. Також показано реактивацію експресії ендогенних маркерів плюріпотентності Nanog та Rex1 у досліджуваних клонах. Експресія Nanog виявилася однаково інтенсивною в усіх досліджуваних клонах і лініях. Реактивація експресії Rex1 в триманих клонах була менш інтенсивною, проте співставною із експресією цього маркера у контрольних лініях. При спонтанному диференціюванні in vitro експериментальних клонів та контрольних клітинних ліній виявлено експресію ранніх ентодермальних (Sox17, AFP) та мезодермальних (tBRA, ?MHC) маркерів на 7-му та 12-ту добу культивування.
Таким чином, клони отриманої клітинної лінії виявилися здатними експресувати ключові фактори плюріпотентрості на рівні транкскриптів та білку. Крім того, дані експериментальні клони формували при спонтанному диференціюванні попередників різних зародкових шарів, що свідчить про їх плюріпотентність. Отримана клітинна лінія може вважатися потенційною лінією іПСК, проте потребує подальшого вивчення.
УДК 615.2 + 616.006 + 661.12
Н.О. МЄШКОВА
Вплив Бромокриптину та Метоклопраміду на пухлинний ріст
ДУ "Інститут фармакології та токсикології НАМН України", Київ;
Вступ: при лікуванні пухлинної хвороби використовуються препарати супроводу для лікування супутніх патологічних станів. Ці препарати, поряд з основною фармакологічною спрямованістю дії, мають не зменшувати ефективність базової протипухлинної терапії. До ліків, які використовуються за певних обставин у хворих на злоякісні новоутворення відносяться протипаркінсонічний засіб Бромокриптин (Д2-дофаміноміметик) та протиблювотний засіб Метоклопрамід (Д2-дофаміноблокатор).
Д2-дофамінорецептори активують аденілатциклазу з можливим накопиченням цАМФ, що має протипухлинну активність. Це може бути притаманним Д2-дофаміноміметику Бромокриптину, але можливі і інші механізми дії, пов’язані з його структурою як похідного лізергінової кислоти (блокада a1- та a2-адренорецепторів).
Проведені дослідження впливу на пухлинний ріст Бромокриптину і Д2-дофаміноблокатора Метоклопраміду.
Методи: дослідження були проведені на білих нелінійних щурах, яким, відповідно до прийнятих методик, було трансплантовано пухлинний матеріал (лімфосаркому Пліса (LS) та карциносаркому Уокера (W 256)). Тварини-носії лімфосаркоми Пліса та карциносаркоми Уокера були розподілені на дві дослідні групи, кожній з яких 6 разів через 48 годин, починаючи з 2 доби після трансплантації пухлин, вводили:
1 групі (LS) – Метоклопрамід, 100,0 мг/кг, 2 групі (W 256) – Бромокриптин, 0,1 мг/кг, та дві контрольні групи (1 – тварини-носії LS, 2 – тварини-носії W 256, яким препарати не вводили).
Показником протипухлинної активності досліджуваних речовин був відсоток гальмування росту пухлин за масою (LS) та за об’ємом (W 256).
Результати: введення тваринам Бромокриптину призводило до стимуляції пухлинного росту +94,47 %. Гальмування росту пухлин під впливом Метоклопраміду у порівнянні з контрольною групою становило 7,20 %.
Висновки: Д2-дофаміноміметик Бромокриптин на карциносаркомі Уокера викликає стимуляцію пухлинного росту, що застерігає від його використання при злоякісних пухлинах. Механізми цієї дії підлягають подальшому вивченню. Д2-дофаміноблокатор Метоклопрамід на лімфосаркомі Пліса практично не проявляє протипухлинної активності, що підтверджує безпечність його використання в умовах пухлинного росту.
УДК 577.152.6:576
В.В. НЕМІШ, О.В. КЕЦА
ГЕНЕРАЦІЯ СУПЕРОКСИДНОГО РАДИКАЛа оксигеназним електрон-транспортним ланцюгом мікросом печінКИ опромінених щурів-пухлиноносіїв
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці; ksen808@mail.ru
Монооксигеназна система (МОС) ендоплазматичного ретикулуму відіграє важливу роль у метаболізмі ксенобіотиків. Компоненти МОС в мембранах ендоплазматичного ретикулуму об’єднуються у два електрон-транспортні ланцюги: 1) NADH-залежний ланцюг (редуктазний), що містить NADH-цитохром b5 редуктазу і цитохром b5; 2) NADPH-залежний ланцюг (оксигеназний), що включає NADPH-цитохром Р450 редуктазу і цитохром Р450 (CYP). У процесі гідроксилювання ксенобіотиків за участю CYP часто відбувається відхилення в монооксигеназному циклі, при цьому не весь оксиген входить до молекули субстрату, а частина його вивільняється у вигляді супероксидного радикала (O2?-). Розвиток в організмі новоутворення або вплив на організм малих доз опромінення може призвести до відхилень у функціонуванні МОС в бік підвищення внутрішньоклітинної концентрації O2?-.
Мета роботи – визначити інтенсивність генерації супероксидного радикала компонентами оксигеназного електрон-транспортного ланцюга мікросомної фракції печінки попередньо опромінених щурів з трансплантованою карциномою Герена.
Дослідження проводили на білих безпородних щурах-самицях, які поділили на групи: І – опромінені щурі; ІІ – щурі з трансплантованою карциномою Герена; ІІІ – щурі, яким карциному Герена трансплантували на фоні дії фракціонованого рентгенівського опромінення в малих дозах. Контролем слугували інтактні щурі. Для оцінки генерації O2?- NADPH-цитохром Р450 редуктазою та CYP був проведений інгібіторний аналіз.
Результати проведених досліджень показали, що в латентну фазу онкогенезу генерація O2?- CYP та NADPH-цитохром Р450 редуктазою залишається на рівні контрольних показників. У період інтенсивного росту карциноми Герена в організмі спостерігається різке відхилення від типової стехіометрії монооксигеназних реакцій, внаслідок інтенсивної генерації O2?- CYP та NADPH-цитохром Р450 редуктазою з одночасним зниженням їх ензиматичної активності.
Трансплантація карциноми Герена на фоні фракціонованого рентгенівського опромінення призводить до підвищення швидкості генерації O2?- компонентами оксигеназного редокс-ланцюга МОС мікросомної фракції печінки щурів-пухлиноносіїв з максимальними значеннями на 7 та 14 доби після зняття дії радіації.
Отже, попередня дія опромінення сприяє активації NADPH-цитохром Р450 редуктази та підвищенню генерації O2?- даним флавопротеїном на 7 та 14 доби після зняття дії радіаційного чинника у щурів-пухлиноносіїв. Водночас знижується ензиматична активність CYP при цьому оксиген не включається в молекулу субстрату, а використовується на генерацію O2?-. Встановлені зміни в системі цитохрому Р450 знижують роль останнього в детоксикаційній функції печінки та метаболізмі лікарських препаратів у організмі попередньо опромінених щурів з трансплантованою карциномою Герена, що може бути однією з передумов для інтенсифікації метаболізму та посиленого росту пухлинної тканини в організмі.
УДК 577. 213.3
Н.М. ПІРКО 1, Д.О. НОВОЖИЛОВ 2, О.Є. КРАСНОПЬОРОВА 2, С.Г. ПЛОХОВСЬКА 2, Н.В. ДОРОШКЕВИЧ 3, Я.В. ПІРКО 1
RAPD- та ISSR-аналіз високопродуктивних ізолятів гливи звичайної (Pleurotus ostreatus (JACQ.: FR.) KUMMER.)
1Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ; nmpirko@mail.ru
2Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, ННЦ "Інститут Біології";
3Донецький національний університет (біологічний факультет), Донецьк
Одним з найбільш популярних і доступних грибів, що культивуються в Україні та країнах СНД є глива устрична або звичайна (Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer.). В природі P. оstreatus представлена в різній мірі ізольованими, самостійно еволюціонуючими біологічними видами-двійниками, які практично не відрізняються за морфологічними ознаками, в той же час вони не можуть між собою схрещуватися. Оскільки популяції гливи досить часто представлені генетично подібними клонами, які виникають завдяки безстатевому розмноженню, то це робить неможливим об'єктивно і достовірно оцінити в природі межі окремих популяцій і навіть видів усередині роду Pleurotus. Варто зазначити, що генотипічне різноманіття цього гриба вивчено досить фрагментарно, тому дослідження генетичного поліморфізму представляє інтерес як для пізнання внутрішньовидової структури P. оstreatus, так і для можливого в подальшому генотипування високопродуктивних ізолятів гриба.
Для оцінки внутрішньовидового та міжвидового генетичного поліморфізму досить широко використовують ДНК маркери. RAPD- та ISSR-маркери належать до найбільш поширених маркерних систем. Для оцінки генетичного поліморфізму P. ostreatus було використано один штам і шість ізолятів, зібраних в різних місцях України та Росії на різноманітних субстратах. Всі досліджені зразки знаходяться в колекції кафедри фізіології рослин Донецького національного університету. За попередньо проведеними дослідженнями морфо-біологічних ознак, зокрема врожайності, частина з них відноситься до високопродуктивних (Дорошкевич, 2010). ДНК для аналізу виділяли з міцелію за допомогою цетилтриметиламонію броміду (ЦТАБ метод). В подальшому ДНК використовували для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з двома RAPD праймерами OPP-15 та OPP-17 (Operon Technologies, USA) та двома ISSR праймерами (ISSR-16 та ISSR-18) (Abd El-Twab, Zahran, 2010). Ампліфікацію з праймерами для одних і тих же зразків проводили що найменше двічі. Амплікони аналізували за допомогою електрофоретичного розділення у 1,5 % агарозному гелі з додаванням бромістого етидію. Отримані електрофоретичні дані переводили у матриці, в яких для кожного праймера вказували кількість смуг (ампліконів або локусів) та наявність (1) або відсутність (0) тої чи іншої смуги. Аналізували тільки відтворювані смуги. У результаті проведеного аналізу P. ostreatus було виявлено 9 RAPD та 16 ISSR локусів. Кількість локусів, що утворилися під час ПЛР з праймером ОРР-15 склала 7, з праймером ОРР-17 – 2 і з праймерами ISSR-16 та ISSR-18 – 8. В цілому всі RAPD та 90% ISSR локусів виявилися поліморфними, що може свідчити про доволі високий рівень генетичного поліморфізму P. ostreatus. Проведена на підставі даних RAPD- та ISSR- аналізу кластеризація ізолятів вказує, що до однієї групи відносяться зразки гливи, які мають певний зв’язок коефіцієнта габітусу з урожайністю гриба (Дорошкевич, 2010).
УДК 616-001.17, 616-089.844, 616.5, 616.5-001.17
О.Є.ПАПУГА, Л.Л.ЛУКАШ, Т.О.РУБАН
ВИВЧЕННЯ МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ ЗООГЛЕЇ ГРИБА Medusomyces gisevi У БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ КОНСТРУКЦІЯХ
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ;
Вступ
Проблема терапії великих і глибоких опікових ран у наш час залишається значною. Для поверхні таких ран під час лікування використовуються донорськи трансплантати. Але їх дефіцит викликає потребу в створенні штучних еквівалентів шкіри, які мають відповідати багатьом важливим вимогам [1]. Але цієї відповідності немає для жодного з існуючих зараз еквівалентів шкіри, тому розробка нових є важливим завданням біотехнології. Серед цих біотехнологічних конструкцій посідають важливе місце ті, у склад яких входять живі клітини (аутологічні або алогенні). Саме ці біоконструкції привертають нашу увагу.
Симбіотичний організм Medusomyces gisevi (чайний гриб) має в собі два складових елементи: дріжжоподібні гриби і бактерії роду Acetobacter. Важливим є те, що клітинна стінка дріжжей містить у собі хітин у кількості 1-3%, який здатен сприяти термальній регенерації [2].
Методи
З поверхні зооглеї знімали тонкий шар, який потім розділяли на маленькі фрагменти. Ці фрагменти занурювали у воду і у такому стані піддавали термічній обробці в автоклаві з метою знищення живих бактерій зооглеї. Далі фрагменти зооглеї на 3 доби переносили в середовище DMEM з додаванням антибіотиків. Після інкубації в середовищі фрагменти переносили в скляну чашку Петрі, і зверху наносили суспензію клітин 4BL (це клітинна лінія, отримана в нашому відділі з клітин периферичної крові здорової людини) із розрахунку 100 000 клітин/см2. Через 1, 3 і 6 діб після початку експерименту проводилося спостереження клітин за допомогою інвертованого мікроскопу. Також через 6 діб від початку експерименту проводилося забарвлення фрагментів зооглеї, що несуть клітини, за допомогою трипанового синього.
Результати
Клітини рівномірно розподілялися всередині шару зооглеї. Розпластання клітин не спостерігалося, форма клітин на протязі 6 днів від дня початку експерименту залишалася круглою. При додаванні фарбника трипанового синього в культуральне середовище практично усі клітини не забарвлювалися.
Висновки
Потрапляючи на поверхню шару зооглеї гриба Medusomyces gisevi, клітини прикріплються і залишаються живими.
Зооглея гриба Medusomyces gisevi може розглядатися як матеріал, який, маючи низьку вартість, здатен слугувати носієм клітин у складі нових біотехнологічних еквівалентів шкіри. Слід проводити подальші дослідження з цим матеріалом.
Література
1. Pruitt BA Jr, Levine NS. Characteristics and uses of biologic dressings and skin substitutes. Arch Surg. 1984, 119: 312-322.
2. Pianigiani E, Andreassi A, Taddeucci P, Alessandrini C, Fimiani M, Andreassi L. A new model for studying differentiation and growth of epidermal cultures on hyaluronan-based carrier. Biomaterials 1999, 20: 1689-1694.
УДК 577.218+616-006
Н. БИЦЬ 1, Г. ПАСІЧНИК 1, 2, О. ПОВОРОЗНЮК 1,2, О. ПОНОМАРЕНКО 1, А. САМОЙЛЕНКО 1, Л. ДРОБОТ 1
ВПЛИВ НАДЕКСПРЕСІЇ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ RUK/CIN85 У КЛІТИНАХ ФЕОХРОМОЦИТОМИ ЩУРА ЛІНІЇ РС12 НА ПРОЯВ ОЗНАК, ХАРАКТЕРНИХ ДЛЯ РАКОВИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН
1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна, Київ;
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;
Вступ. Виникнення та розвиток злоякісних пухлин пов'язані з функціонуванням ракових стовбурових клітин (CSCs). Відомо, що CSCs характеризуються здатністю до самовідтворення, активацією окремих ензимів (алкогольдегідрогеназа), надекспресією мембранних транспортерів родини АВС і специфічних поверхневих маркерів. Проводиться великий об’єм робіт з дослідження молекулярних факторів, залучених до формування та підтримання фенотипу CSCs, проте роль окремих адаптерних протеїнів залишається нез’ясованою. Відомо, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 виконує важливу роль не тільки у підтриманні гомеостазу нормальних клітин, але також залучений до регуляції шляхів злоякісної трансформації клітин. Метою роботи було оцінити вклад адаптерного протеїну Ruk/CIN85 до механізмів формування та підтримання CSCs-подібного фенотипу у клітинах феохромоцитоми щура лінії РС12.
Методи. Досліди проводили на клітинах феохромоцитоми щура лінії РС12 дикого типу та зі стабільною надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85. Активність Akt кінази, вміст транскрипційних факторів Id1 та MATH2/NEUROD6 визначали методом Вестерн-блот аналізу. Вплив пероксиду водню на метаболічну активність клітин аналізували МТТ тестом. Сфероїди отримували шляхом культивування клітин на низькоадгезивному пластику у детермінованому середовищі.
Результати. Було отримано клональні сублінії клітин РС12 з надекспресією EGFP-Ruk, які відрізнялись як за морфологічними, так і функціональними ознаками від контрольних клітин. Зокрема, стабільні трансфектанти характеризувались тенденцією до клонального росту з формуванням кластерів та втратою здатності до диференціювання під дією NGF. Вплив надекспресії Ruk/CIN85 на активацію сигнальних шляхів в клітинах РС12 аналізували шляхом оцінки рівня фосфорилювання Akt кінази. Було показано, що надекспресія протеїну Ruk/CIN85 у клітинах РС12 супроводжується конститутивною активацією Akt кінази. Встановлено також, що клітини РС12 з надекспресією ЕGFP-Ruk мають вищу резистентність до клітинної смерті, викликаної додаванням 500 мкМ пероксиду водню. В EGFP-Ruk-надекспресуючих клітинах спостерігався високий рівень експресії Id1 та низький рівень експресії MATH2/NEUROD6 порівняно з контрольними клітинами, що характерно для CSCs. Окрім того, стабільні трансфектанти виявились здатними до ефективного формування сфероїдів при культивуванні в детермінованому середовищі на низькоадгезивному пластику.
Висновки. Отримані дані свідчать про потенційну регуляторну роль адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у розвитку та підтриманні фенотипу, характерного для CSCs, у клітинах феохромоцитоми щура лінії РС12.
УДК 517.121
М. САВЧУК
ШЛЯХИ МОДИЛЮВАННЯ РІВНЯ ФОРМАЛЬДЕГІДУ В ОРГАНІЗМІ ТВАРИН
Інститут біохімії імені О.В.Палладіна, НАН України, Київ;
Формальдегід (ФА) утворюється ендогенно в процесі метаболізму амінокислот і ксенобіотиків, а також може надходити з екзогенних джерел. Регуляцію концентрації вільного ФА у тканинах організму здійснюють ферменти семікарбазид чутлива аміноксидаза (SSAO), яка утворює ФА із метиламіну – інтермедіату катаболізму креатину, фосфатіділхоліну, адреналіну та деяких ксенобіотиків; а також глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа, яка є ідентичною алкогольдегідрогеназі класу ??? (ADH3) та здійснює основний шлях зв’язування вільного ФА. ФА проявляє мутагенну, геннотоксичну, імуногенну та канцерогенну дії, є одним із чинників розвитку злоякісних новоутворень дихальної системи та лейкемії у людини, здатний утворювати внутримолекулярні зшивки в білках і нуклеїнових кислотах та міжмолекулярні зв’язки між цими сполуками. При певних патологічних станах можлива гіперпродукція ФА, тому зважаючи на його токсичність, зниження рівня ФА є актуальним питанням. З іншого боку, певні фармакологічні препарати такі як дапсон та сульфметоксазол, мають побічну дію через утворення метаболіту - гідроксиламін, ФА здатен зв’язувати гідроксиламін, зменшуючи тим самим його токсичну дію. Тому при певних умовах існує необхідність підвищувати вміст ФА в організмі.
Мета роботи експериментально дослідити можливість підвищення та зниження рівня ФА в організмі.
В проведених на щурах дослідах було встановлено наступне.
- Зменьшення рівня ФА спричиняє семікарбазид – інгібітор SSAO, при пероральному введенні в дозі 200 мг/кг через 40хв вміст ФА в тканині печінки становив (78+ 13) нмоль/г тканини (контроль – (139+ 24) нмоль/г зменшення на 45%, Р<0,05); а також розчину дімедон, на моделі рабдоміолізу (РМ) перитоніальне введення в дозі 100 мг/кг вміст ФА в тканині печінки становив: –РМ – (380±60) нмоль/г тканини РМ + дімедон– (80±15) нмоль/г (контроль – (130±26) нмоль/г зменшення на 79%, Р<0,05).
- До збільшення рівня ФА призводить метиламін – субстрат SSAO, пероральне введення в дозі 250 мг/кг через 40хв вміст ФА в тканині печінки становив: (164+ 28) нмоль/г тканини (контроль – (128+ 21) нмоль/г, збільшення на 22%, Р<0,05); тіопролин - амінокислота, що є продуктом взаємодії ФА та цистеїну; пероральне введення в дозі 446 мг/кг через одну годину: ФА - (183±39) нмоль/г тканин (контроль – (125±23) нмоль/г збільшення на 46%, Р<0,05).
Таким чином, експериментально доведена можливість моделювання рівня ФА в організмі. Так для підвищення рівня ФА можна використати фаримпрепарати: метиламін та тіопролин, а для зменшення рівня ФА: семікарбозид та дімедон.
УДК 57.085.1:57.088.3:577.218
Я.Р. СІНДАРОВСЬКА 1, І.М. ГЕРАСИМЕНКО 1, М.Ю. ВАСИЛЕНКО 1, М.Г. МАЗУР 1, А.А. ПЕТЕРСОН 1, Ю.В. ШЕЛУДЬКО 1, І.В. ГОЛДЕНКОВА-ПАВЛОВА2
СТВОРЕННЯ ГЕНЕТИЧНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ГІБРИДНИХ БІФУНКЦІОНАЛЬНИХ БІЛКІВ ДЛЯ ЕФЕКТИВНОЇ ЕКСПРЕСІЇ І ДЕТЕКЦІЇ В РОСЛИНАХ
1Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, Україна; sindarovskaya@ukr.net
2Інститут загальної генетики ім. Н.І. Вавілова РАН, Москва, РФ
Вступ. Головними перешкодами для біотехнологічного отримання рекомбінантних білків з рослин є зазвичай низький рівень накопичення цільового продукту та складність селекції стабільно високопродуктивних ліній і подальшого контролю рівня експресії трансгену. В нашій роботі шляхом трансляційного злиття послідовностей цільових та репортерних генів з додаванням транспортних сигналів були створені гібридні експресійно-репортерні системи, використання яких, як передбачається, з одного боку призведе до стабілізації цільового продукту зі збереженням функціональної активності, з іншого – дозволить проводити моніторінг накопичення рекомбінантного білка.
Матеріали і методи. Для молекулярного клонування використовували стандартні методи. У роботі використовували штам Escherichia coli XL1Blue і Agrobacterium tumefaciens GV3101. Транзієнтну експресію проводили в рослинах Nicotiana excelsior і N. benthamiana.
Результати й обговорення. Для створення гібридних генів інтерферону альфа 2b людини (IFN), соматотропного гормону людини (hGH) і зеленого флуоресцентного білка (GFP) отримані в результаті ПЛР фрагменти ДНК були клоновані у вектор pGEM-Т easy з подальшим лігуванням із послідовністю гена репортерного білка термостабільної ліхенази Clostridium thermocellum licBМ3. Подібним шляхом було отримано гібридний ген, який містив послідовності антигенів Mycobacterium tuberculosis (Ag85b та ESAT-6) та GFP. Створені гібридні гени IFN::licBМ3, hGH::licBМ3, GFP::licBМ3, Ag85b(?TMD)::GFP та потрійний гібрид Ag85b(?TMD)::ESAT-6::GFP були перенесені у вектори адаптовані для рослинної експресії. В гібридних генах послідовність зрілого IFN було поєднано із сигнальним пептидом рослинного білка-шаперона кальретикуліну, що, як було показано раніше, збільшує накопичення продукту у порівнянні із нативним лідерним пептидом.
Ліхеназну активність було виявлено після транзієнтної експресії всіх гібридних генів, що включали її послідовність. Внаслідок експресії гена IFN::licBМ3 було задетектовано активність інтерферону не меншу, ніж при експресії нативного гена. В біфункціональному репортері GFP::licBМ3 разом із ліхеназною активністю спостерігалась флуоресценція GFP. Показано, що поєднання туберкульозного антигену Ag85B(?TMD) з репортером GFP дає змогу локалізувати місця його накопичення в клітинах, а рівень експресії злитого продукту вище, ніж самого антигену.
Висновки Створено серію гібридних генів біфункціональних білків для ефективної експресії і детекції в рослинах.
Підтримка: Грант НАНУ (УкрІНТЕІ №0110U006061) і ДФФД-РФФД грант F40.4/021.
УДК 577.346:577.217+592/598:539.1.047
Д.О. СОКОЛОВА, А.П. КРАВЕЦЬ, Г.С. ВЕНГЖЕН
ЗВ'ЯЗОК ЗМІНИ ПРОФІЛЮ МЕТИЛУВАННЯ ФУНКЦІОНАЛЬНО РІЗНИХ ЧАСТИН ДНК ТА ВИХОДУ НЕСТАБІЛЬНИХ ХРОМОСОМНИХ АБЕРАЦІЙ ПІД ВПЛИВОМ ФРАКЦІОНОВАНОГО УФ-С ОПРОМНЕННЯ
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ;
Дослідження реакції організмів на повторювані впливи знаходиться в центрі уваги певних біологічних та медичних дисциплін. В радіобіології це питання широко досліджується при вивченні ефектів фракціонованого опромінення та адаптивної відповіді. В сучасній радіобіології наявні дані щодо конститутивних та індуцибельних механізмів захисту та відновлення біологічних систем від радіаційних впливів. Одним із можливих підходів до оцінки включення індуцибельних механізмів пов'язаний з дослідженням змін профілей метилування транскрибованої частини ДНК.
Відомо, що метилування, як єдина форма ковалентної модифікації ДНК без зміни її нуклеотидної послідовності, є одним із основних епігенетичних механізмів контролю генної експресії. Разом з тим, метилування є поліфункціональним процесом і відіграє значну роль і в стабілізації структури ДНК.
Дана доповідь присвячена викладенню результатів, отриманих при дослідженні зв’язку зміни профілю метилування в функціонально різних частинах ДНК та виходу хромосомних аберацій за умов фракціонованого УФ-С опромінення у дозах 6,2 – 9 кДж/м2.
Використано поєднання рестрикційного аналізу з рестриктазами HpaII, MspI, MboI та ПЛР з праймерами internal transcribed space – ITS1 (19b) ITS4 (20b), та inter simple sequence repeat – ISSR (14b). В якості показника радіаційного впливу використовувалась зміна рівня виходу нестабільних хромосомних аберацій.
Отримані результати свідчать про зміни в профілі метилування сателітної та транскрипційно активної частини ДНК при опроміненні в режимі фракціонування і в залежності від часового інтервалу між фракціями.
УДК 577.121:612.398.192:615.9
К.О. ТОКАРЧУК1, О.В. ЗАЙЦЕВА2, Л.Г.КАПУСТЯНЕНКО1
ДОСЛІДЖЕННЯ УЧАСТІ АЛЬДЕГІДІВ У РОЗВИТКУ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ
1Інститут біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України, Київ; katiywa@ukr.net
2Донецький національний університет, Донецьк
При оксидативному стресі (ОС) відбувається інтенсифікація процесів перекисного окиснення ліпідів з утворенням альдегідів, які викликають постсинтетичні модифікації білків і ДНК, порушуючи їх функціонування. Ми вважаємо, що ці ендогенні альдегіди є не тільки продуктами ОС, але й можуть ініціювати цей процес.
Мета роботи: експериментально довести участь альдегідів у розвитку ОС. Були використані наступні експериментальні моделі ОС: рабдоміоліз (РМ) in vivo та залізо-індукований ОС на тимоцитах щура in vitro. Для з’ясування участі альдегідів використовували димедон (5,5-диметил-1,3-циклогександіон, С8Н12О2) – акцептор альдегідів.
Експеримент in vivo: для індукції РМ щурам вводили в обидва стегнові м’язи 50% розчин гліцерину (10 мл/кг). На 4 добу реєстрували підвищення вмісту гему в плазмі крові у 4 рази, збільшення гемоксидазної активності в печінці до (51±8) нмоль білірубіну хв/мг протеїну (контроль (8,1±2,0)нмоль хв/мг). Вміст альдегідів в печінці збільшився в 2,9 рази (0,38±0,09) мкмоль/г, контроль (0,13±0,02) мкмоль/г. Щоденне пероральне введення 1% димедону (10 мл/кг) призвело до суттєвого зменшення вмісту альдегідів (0,08±0,01) мкмоль/г тканини. Основні показники ОС змінились наступним чином: СО-групи протеїнів в плазмі крові: контроль - (0,98±0,12) нмоль/мг, РМ - (3,4±0,80) нмоль/мг, РМ+димедон - (2,1±0,4) нмоль/мг; в печінці: контроль - (1,3±0,2) нмоль/мг, РМ - (3,7±0,9) нмоль/мг, РМ+димедон - (2,0±0,5) нмоль/мг; вміст ТБК-продуктів у печінці: контроль - (56±6)нмоль/мг, РМ - (91±9) нмоль/мг, РМ+димедон - (35±9) нмоль/мг.
Експеримент in vitro: для індукції ОС до суспензії тимоцитів щура (1·106 кл/мл в середовищі Хенкс, рН 7,3) додали розчин FeSO4 (40мкМ) та аскорбінової кислоти (100мкМ), інкубували 6 год при 37°С. Для з’ясування ролі альдегідів додали димедон (200 мкМ).
Додавання FeSO4 викликало збільшення ТБК-продуктів відносно контролю на 2-гу годину інкубації в 2,6 рази, на 4-ту год – в 2 рази, на 6-ту год – в 2,1 рази, тоді як при додаванні димедону цей показник зменшився: на 2-гу год – в 1,2 рази, на 4-ту год – 1,1 рази, на 6-ту год – в 1,5 рази. Електрон-транспортні процеси мітохондрій з використанням барвника Alamar Blue підвищились в порівнянні з контролем в 1,2 рази за 6 годин інкубації, при додаванні димедону ці процеси також підвищились ще в 2 рази в порівнянні з FeSO4.
Висновки: результати досліджень доводять, що ендогенні альдегіди є не тільки продуктами ОС, але й беруть участь у його розвитку. Так, введення акцептору альдегідів димедону на моделі РМ призводить до зменшення вмісту карбонільних груп в плазмі крові на 61%, в печінці на 54%, ТБК-продуктів на 38%. Аналогічні зміни реєстрували на моделі ОС in vitro.
УДК 577. 112
Л. П. УРВАНТ, Н. Е. ЛУГОВСЬКА, М. О. ПИДЮРА
ЛОКАЛІЗАЦІЯ ЕПІТОПУ ФІБРИНСПЕЦИФІЧНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТІЛА І-3С В ДІЛЯНЦІ 126-134 ? ЛАНЦЮГА ФІБРИНУ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Ключовим протеїном системи зсідання крові є фібриноген (Fg). В плазмі крові Fg перетворюється на фібрин внаслідок відщеплення тромбіном двох пар фібринопептидів А та В (FpA і FpB, відповідно). Утворений таким чином фібрин здатний спонтанно полімеризуватись, формуючи фібриновий згусток. В первинній полімеризації – побудові протофібрил – бере участь пара комплементарних сайтів полімеризації А-а та С-с. Міцність та розгалуження фібринового згустку забезпечується латеральними контактами між сусідніми протофібрилами. На сьогоднішній день найменш дослідженим є питанням про локалізацію сайтів латеральної асоціації (окрім сайтів В-b).
Раніше було показано, що при перетворенні Fg в фібрин у фрагменті В?118-134 ? ланцюга молекули фібрину експонується епітоп монАТ І-3с та сайт латеральної асоціації протофібрил. Було встановлено, що експонування відбувається внаслідок структурної перебудови лейкоподібного та суперспірального фрагментів Е регіону після відщепленні FpA (E.V.Lugovskoy et al, 2012). Метою представленої роботи було локалізувати епітоп монАТ І-3с у ділянці 118-134 ? ланцюга фібрину та дослідити механізм його експонування.
Із застосуванням методу турбідиметричного аналізу та конкурентного імуноферментного аналізу (ІФА) показано, що з двох синтетичних пептидів, які мали послідовності В?109-126 та В?126-138 фібриногену, лише другий інгібував полімеризацію фібрину та зв’язування монАТ І-3с з фібрином. Порівняльний аналіз зв’язування монАТ І-3с з фібрином людини, бика, коня, щура та кроля методами поверхневого плазмонного резонансу та ІФА показав, що монАТ І-3с зв’язувалось з фібрином людини, коня й кроля і не зв’язувалось з фібрином бика і щура.
Співставлення первинних послідовностей сайтів Bb118-134 свідчить про локалізацію епітопу монАТ І-3с в ділянці 126-134 ? ланцюга фібрину та про провідну роль амінокислотного залишку К130 в його експонуванні. Комп?ютерний аналіз ступеню взаємодії ?, ? і ? ланцюгів в ділянках, які знаходяться поряд із сайтом В?118-134 в Х фрагменті Fg та фібрину, показав, що ймовірність взаємодії між ? і ?, ? і ? ланцюгами зменшується на 14 та 15%, відповідно, а ймовірність взаємодії між ? і ? ланцюгами зростає на 36%.
На основі отриманих даних ми припустили, що епітоп монАТ І-3с локалізований в ділянці 126-134 ? ланцюга фібрину; при перетворенні Fg у фібрин структурні зміни відбуваються також і у вказаному фрагменті; зміна міцності взаємодії ланцюгів між собою, ймовірно, призводить до експонування епітопу монАТ І-3с в процесі перетворення Fg у фібрин.
УДК 577.152.3
Р.В. ФАФУЛА
КІНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ ГІДРОЛІЗУ АТР ОУАБАЇНЧУТЛИВОЮ Na+, K+-АТР-азою ТА Сa2+, Mg2+-АТР-азою ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ХВОРИХ НА РЕВМАТОЇДНИЙ АРТРИТ ТА АНКІЛОЗИВНИЙ СПОНДИЛОАРТРИТ
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів;
Протягом останніх десятиліть дослідниками акцент робиться на імунологічні порушення в патогенезі ревматичних захворювань. В цьому плані найбільшу увагу привертають лімфоцити, які є центральною ланкою в імунологічних реакціях та відіграють провідну роль в забезпеченні компенсаторно-пристосувальних реакцій організму. Дослідження ензиматичного спектру лімфоцитів широко використовується при вивченні автоімунних та інших захворюваннях і дає важливу інформаційну оцінку про їх функціональний стан.
В наших попередніх дослідженнях виявлено дефект гідролазної активності оуабаїнчутливої Na+, K+-АТР-ази та Са2+, Mg2+-АТР-ази плазматичної мембрани і мембран ендоплазматичного ретикулуму лімфоцитів периферичної крові хворих на ревматоїдний артрит та анкілозивний спондилоартрит. Проте, достовірно не відомо, який саме механізм змінює активність ензиму.
Мета дослідження полягає у встановленні можливих механізмів дисфункції оуабаїнчутливої Na+, K+-АТР-ази та Са2+, Mg2+-АТР-ази лімфоцитів периферичної крові хворих на ревматоїдний артрит та анкілозивний спондилоартрит.
Моноядерні лімфоцити периферичної крові виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові донорів і хворих у градієнті густини фікол-тріумбрасту (r = 1,08 г/см3). Для пермеабілізації мембран лімфоцитів та розкриття латентної Са2+, Mg2+-АТР-азної та Nа+, К+-АТР-азної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,1 та 0,2 % сапонін відповідно. Nа+, К+- та Са2+, Mg2+-АТР-азну активність лімфоцитів визначали спектрофотометрично, реєструючи утворення Pi за методом W. Rathbun, V. Betlach. Nа+, К+-АТР-азну активність визначали за різницею між величиною загальної і базальної АТР-азної активності у присутності оуабаїну. Активність Са2+, Mg2+-АТР-аз лімфоцитів оцінювали як різницю між активністю АТР-азних систем у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах. Для розділення сумарної Ca2+, Mg2+-АТР-азної активності на тапсигаргіннечутливу та тапсигаргінчутливу компоненти до стандартного Ca2+- та Mg2+-вмісного середовища інкубації додавали тапсигаргін. Уявні кінетичні параметри, які характеризують АТР-гідролазну реакцію – константу Міхаеліса-Ментен та початкову максимальну швидкість реакції гідролізу АТР визначали за у координатах Лайнуівера-Берка.
Встановлено, що за умов розвитку ревматичної патології в імунокомпетентних клітинах інгібування оуабаїнчутливої Na+, K+-ATР-азної активності відбувається не рахунок зменшення числа обертів ензиму, а за рахунок зниження спорідненості оуабаїнчутливої Na+, K+-ATФ-ази до АТР. Водночас, інгібування Са2+, Mg2+-АТР-азної активності плазматичної мембрани і мембран ендоплазматичного ретикулуму лімфоцитів відбувається не по конкурентному, а по змішаному типу. Стимуляція лімфоцитів антигенами запускає каскад енергетично-залежних процесів, які ведуть до перерозподілу макроергів у клітині з чим ймовірно також можуть бути пов’язані зміни спорідненості АТР-аз лімфоцитів периферичної крові до субстрату.
УДК 612.11:576.314+616.379-008.64
І. В. ФЕРЕНЦ, М. Я. ЛЮТА, І. В. БРОДЯК, Н. О. СИБІРНА
ВПЛИВ АГМАТИНУ НА ЗМІНИ У СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІЙ ОРГАНІЗАЦІЇ МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ
Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів;
Вуглеводні детермінанти у складі поверхневих глікопротеїнів та гліколіпідів мембран еритроцитів відіграють вирішальну роль у процесах міжклітинних взаємодій цих клітин між собою та ендотеліоцитами кровоносних судин і визначають тривалість їхнього життя у кров’яному руслі.
Метаболічні зміни, які відбуваються в організмі на фоні тривалої гіперглікемії, викликають порушення еритропоезу та викликають зміни у структурі чи кількості поверхневих глікокон’югатів мембран еритроцитів, підвищуючи їхні адгезивні властивості. Важливе значення у цих процесах відіграють залишки сіалових кислот, наявність яких у термінальному положенні олігосахаридних ланцюгів глікокон’югатів визначає сумарний негативний заряд мембрани клітини, забезпечуючи антиадгезивний ефект.
Метою роботи було дослідження загального вмісту сіалових кислот та зміни співвідношення їхнього вмісту у складі мембранних глікопротеїнів та гліколіпідів; типу глікозидного зв’язку сіалових кислот із субтермінальними вуглеводами та рівня експонування галактозильних залишків у структурі поверхневих глікокон’югатів мембран еритроцитів за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) на фоні введення агматину.
Загальний вміст сіалових кислот у мембранах еритроцитів визначали методом Ворена. Для аналізу змін у структурі мембранних глікокон’югатів проводили обробку еритроцитів папаїном (відщеплення надмембранної частини глікопротеїнів) та нейрамінідазою з C. perfringens (десіалювання глікокон’югатів), після чого здійснювали лектинофенотипування клітин та досліджували їхню агрегаційну здатність, використовуючи лектини різної вуглеводзв’язувальної специфічності.
Встановлено, що розвиток експериментального цукрового діабету супроводжується зменшенням кількості глікопротеїнових рецепторів на поверхні мембран еритроцитів на 34%, що, можливо, зумовлено порушенням синтезу вуглеводних детермінант de novo при дозріванні цих клітин у кістковому мозку. Порівняно із контрольними тваринами виявлено зменшення вмісту сіалових кислот як результат десіалювання гліколіпідів і глікопротеїнів, що супроводжується підвищенням демаскування субтермінальних залишків галактози. Такі перебудови у структурі вуглеводних детермінант глікокон’югатів можуть бути пов’язані з активацією мембранозв’язаних сіалідаз і призводити до пришвидшення елімінації еритроцитів з кров’яного русла.
Введення агматину тваринам з ЕЦД зумовлювало зростання кількості глікопротеїнових рецепторів більш ніж удвічі порівняно з діабетом. Встановлено збільшення загального вмісту сіалових кислот та підвищення їхнього експонування у термінальному положенні олігосахаридних послідовностей гліканів. Водночас підвищувалось зв’язування із мембранними глікокон’югатами галактозоспецифічного лектину. Таким чином, введення агматину стимулює вихід у кров’яне русло функціонально зрілих клітин та відновлює рівновагу між процесами сіалювання-десіалювання.
УДК 615.324: 577.144
О.Ф.ЧЕЧУЙ
ДІЯ ХІТОЗАНУ НА ПОКАЗНИКИ ЦИТОЛІЗУ ТА ПЕРОКСИДНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У ПЕЧІНЦІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН
ЗА ЇХ ГОСТРОГО ОТРУЄННЯ
Харківський національний медичний університет, Харків;
Розвиток гепатитів супроводжується синдромом ендогенної інтоксикації. Полісахариди з морських гідробіонтів є джерелом біологічно активних речовин, зокрема, хітозан є продуктом деацетилювання хітіну – скелетного полісахариду панцирю безхребетних. Відомо, що препарати хітозану виявляють радіозахисну, ранозагоювальну дію, володіють ентеросорбційними властивостями.
Метою даного експериментального дослідження було з’ясування дії хітозану на показники цитолізу та пероксидне окиснення ліпідів за гострого отруєння мишей.
Дослідження проводили на мищах-самцях масою тіла 16-17 г. Гостре отруєння мишей моделювали шляхом одноразового введення через зонд у шлунок мишей анальгіну у дозі 170 мг на 1 кг (0,5 LD 50) у вигляді завису 3% крохмального слизу з розрахунку 2 мл на 1 кг маси тіла миші на протязі 2-х діб. Хітозан використовували в дозі 220 мг/кг за 2 год до та за 4 год після введення анальгіну. Тварин декапітували через добу після останнього введення хітозану. В експериментах використовували кров та печінку, які забирали під легким ефірним наркозом. Визначали активність лужної фосфатази (ЛФ), глутамілтранспептидази (ГГТП), лактатдегідрогенази (ЛДГ) як показників цитолізу гепатоцитів, а також рівень малонового діальдегіду (МДА) як продукту ліпопероксидації та вміст ?-токоферолу як антиоксиданту.
Виявлено збільшення активності ЛФ за гостого отруєння анальгіном в плазмі крові та гомогенаті печінки мищей в 1,6 разів та 53%, відповідно, що вказує на розвиток холестатичних порушень у печінці, а за дії хітозану у гомогенаті печінки активність ферменту підвищується лише на 25% порівняно з контрольною групою, але у плазмі крові – лише на 34%. Активність ГГТП в плазмі крові мишей у стані отруєння анальгіном зменшується на 37%, а на тлі дії хітозану - на 22% відносно контролю. Ферментативна активність ЛДГ за токсичної дози парацетамолу збільшується у 2,3 рази у гомогенаті печінки, що свідчить про активацію кінцевого етану гліколітичного шляху та віддзеркалює порушення у мембранах гепатоцитів їх функціонального стану, а хітозан зменшує гіперферментемію на 37%, що вказує на мембранопротекторні властивості даної речовини. Інтоксикація тварин анальгіном призводить до активації пероксидного окиснення ліпідів та інгібування антиоксидантної системи, що виявляється у збільшенні вмісту МДА у 2,1 рази у гомогенаті печінки і та у 1,7 разів в плазмі крові, та зменшенні вмісту антиоксиданту ?-токоферолу у плазмі та гомогенаті печінки на 48% та у 1,7 рази, відновідно, що свідчить про токсичне ураження печінки. Хітозан сприяє зменшенню в гомогенаті печінки рівня малонового діальдегіду у 1,4 рази зі збільшенням вмісту ?-токоферолу на 33%. Таким чином, хітозан сприяє нормалізації метаболізму в уражених клітинах печінки та зменшенню ендогенної інтоксикації організму.
УДК 577.1:612.017.1:661.5:53.083.2
І.М. ЧУМАЧЕНКО, Л.Г. КАПУСТЯНЕНКО, С.Г. ШАНДРЕНКО
ВЗАЄМОРЕГУЛЯЦІЯ ОБМІНУ NO ТА ЗАЛІЗА В ОРГАНІЗМІ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Нами висунута гіпотеза, що існує взаєморегуляція обміну NO та заліза в організмі. Для підтвердження даної гіпотези ми використали дві експериментальні моделі на щурах: гіперпродукції NO (інтратрахеальне введення азбесту) та збільшення вмісту лабільного заліза на моделі рабдоміолізу (РМ).
Метод 1: Щурам інтратрахеально ввели суспензію азбесту марки А6-45 (5 мг/кг) в 0,2 мл фізрозчину. Для оцінки змін в обміні заліза та NO використовували метод електронного парамагнітного резонансу.
Результат 1: Показано, що при введенні азбесту відбувається суттєве збільшення вмісту NO в тканині легенів. Так, на 3,6,10 – добу цей показник становив відповідно: 2,0±0,7; 2,6±0,9; 2,4±0,9 мкмоль/г·год (контроль 0,17±0,08). На фоні гіперпродукції NO спостерігаються зміни в обміні заліза. У контрольних тварин Fe3+ сироватки крові повністю включене до трансферину. В крові дослідних тварин утворюється “нетрансфериновий” фонд Fe3+. Таке залізо знаходиться в лабільній формі, здатне до хімічних взаємодій та є ініціатором оксидативного стресу. Так, розподіл нетрансферинового/трансферинового Fe3+ в крові складав: контроль – 0%, 3 дні – 60%, 6 днів – 72%, 10 днів – 71%. Коефіцієнт кореляції між змінами вмісту NO та Fe3+ – 0,98.
Метод 2: Для моделі РМ щурам в обидва стегнових м’язи ввели по 0,5 мл 50% гліцерину. Стан заліза в крові визначили стандартним набором Felicit. Обмін NO методом ELISA та біохімічними тестами.
Результат 2: При РМ внаслідок пошкодження м’язів відбувається вивільнення вмісту м’язових клітин (електроліти, міоглобін та інші саркоплазматичні протеїни) в кров’яне русло, а також індукція ензимів з гемоксидазною активністю. При масовій утилізації вільних гемопротеїнів можливе формування лабільного фонду заліза. Так, розподіл нетрансферинового/трансферинового заліза в крові складав (контроль – 0%; 1 день – 200%; 3 дні – 280%; 6 днів – 175%; 10 днів – 160%). На фоні збільшення вмісту лабільного заліза відбувається індукція NO-синтази. Так, на 4 день вміст загальної NO синтази в печінці становив 0,84 нмоль/мг протеїну (контроль 0,43).
Для з’ясування участі лабільного заліза в регуляції обміну NO був використаний унітіол, який здатен утворювати стабільний залізосірчаний комплекс з Fe2+ та Fe3+. Введення унітіолу (350 мг/кг) на 4-й день призвело до зменшення вмісту лабільного заліза у крові на 70%. У цих тварин також відбулося зменшення показників обміну NO на 30% (NO синтаза, нітрозопролін, нітротирозин) .
Висновки: На експериментальних моделях гіперпродукції NO та збільшення вмісту лабільного заліза в крові отримані докази взаєморегуляції обміну NO та заліза в організмі. Зменшення вмісту лабільного заліза шляхом введення унітіолу на моделі РМ призвело не тільки до зменшення концентрації метаболітів NO, що може бути наслідком акцептування NO комплексом унітіол-залізо, але і до зменшення вмісту загальної NO синтази. Такі зміни свідчать саме про регуляторні впливи.
УДК 616.33-002.44:539.1.047
Д.В.ШЕЛЕСТ, А.Є.ШЕВЧЕНКО, В.А. КОВАЛЬОВА, Л.І. ОСТАПЧЕНКО
СТРУКТУРНІ КОМПОНЕНТИ ТИМОЦИТІВ ЩУРІВ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УЛЬЦЕРОГЕНЕЗУ
ННЦ „Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Київ; Diemondos@ovi.com
Виразкова хвороба шлунка є одним з найпоширеніших захворювань органів травлення людини у світі. Розвиток виразкової хвороби впливає на інші органи та системи органів, такі як печінка, підшлункова залоза, імунна система. Дослідження імунного статусу і біохімічних характеристик Т-лімфоцитів при ульцерогенезі є важливим аспектом для розуміння механізмів розвитку виразки, впливу на організм вцілому та можливості розробки профілактики імунодефіциту при цьому захворюванні.
В дослідах використовували білих нелінійних щурів масою 200±10 г. Етанолову модель виразки викликали за методом Окабе. Стресову модель виразки створювали за методом С.Д.Гройсмана та Т.Г.Каревіної. Визначення вмісту фракцій нейтральних та полярних ліпідів проводили хроматографічним методом. Білковий склад оцінювали методом ДСН-електрофорезу в поліакриламідному гелі за Леммлі. Для обрахунку кількісного білкового складу використовували програму Total Lab. Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами статистики.
В результаті дослідження кількісного складу ліпідів в тимоцитах щурів було встановлено, що при етаноловій виразці зростає вміст холестеролу в 1,7 рази, триацилгліцеролу – в 2 рази та жирних кислот – в 2,2 рази. При стресовій моделі було відмічено зростання вмісту холестеролу в 1,5 рази, триацилгліцеролу – в 2,3 рази та жирних кислот – в 1,9 раз відносно контролю.
В результаті дослідження кількісного складу фосфоліпідів в тимоцитах щурів було встановлено, що при етанольній та стресовій виразці зменшується вміст фосфатидилетаноламіну в 1,5 та у 1,2 рази відповідно, відносно контролю. При стресовій моделі було відмічено зростання кількості лізофосфатидилхоліну в 1,7 рази, та зменшення фосфатидилінозитолу в 1,3 рази, відносно контролю.
За умов стресової виразки шлунка у клітинах тимусу не було виявлено білок з масою 24 кДа, який був присутній у контролі. Було встановлено зростання вмісту білку з молекулярною масою 39 кДа у 1,5 рази, а вміст білку з молекулярною масою 32 кДа зменшення у 2,6 рази.
Зміни ліпідного складу тимоцитів щурів за умов експериментального ульцерогенезу можуть призвести до порушення: текучості та плинності мембран, цілісності клітинної мембрани, цілісності мембран органел таких, як мітохондрії, ядро та ендоплазматичний ретикулюм, процесів передачі рецепторних сигналів. При порушенні цілісності мембран можуть піддаватися руйнуванню й інші важливі складові біополімери такі, як нуклеїнові кислоти та білки.