Екзоцитоз та транспорт глутамату через високоафінні Na+–залежні транспортери в тромбоцитах

Екзоцитоз та транспорт глутамату через високоафінні

Na⁺–залежні транспортери в тромбоцитах

 

Касаткіна Людмила Олександрівна

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ нейрохімії

 

Дослідження тромбоцитів в переважній своїй більшості стосуються їх участі у процесах зсідання крові. Однак окрім своєї основної функції, яку тромбоцити виконують у системі гемостазу, вони є об’єктом уваги нейробіологів. Це зумовлено тим, що в тромбоцитах представлений комплекс молекул, залучених до транспорту глутамату та серотоніну, а також рецептори до цих нейромедіаторів.

Глутамат є основним збуджуючим медіатором у центральній нервовій системі (ЦНС) ссавців. Він, зокрема, бере участь процесах розпізнавання, пам'яті, навчання тощо. Єдиним шляхом швидкого видалення нейромедіатору з синаптичної щілини є його транспорт високоафінними Na⁺-залежними глутаматними транспортерами ЕААТ 1-5, локалізованими у плазматичній мембрані нейронів і гліальних клітин. Глутаматні транспортери плазматичної мембрани використовують Na⁺/K⁺ електрохімічний градієнт як рушійну силу для транспорту глутамату в цитозоль. Тромбоцити експресують високоафінні Na⁺-залежні глутаматні транспортери нейронального та гліального типу (ЕААТ 1-3) на плазматичній мембрані. Глутамат з цитозолю акумулюється в секреторних гранулах тромбоцитів за участю двох типів везикулярних транспортерів глутамату VGLUT1 та 2. Крім того, на мембрані тромбоцитів представлені іонотропні (NMDA-, AMPA- та каїнатні) та метаботропні (mGlu3,4) глутаматні рецептори.

Система високоафінного Na⁺-залежного транспорту глутамату в тромбоцитах досі не охарактеризована детально, а нові експериментальні данні у цій галузі мають важливе фундаментальне та практичне значення. Порівняльний аналіз процесів активного накопичення та вивільнення глутамату в тромбоцитах та ізольованих нервових закінченнях головного мозку дозволяє виявити особливості цих процесів в кожному з об’єктів та визначити фактори, що модулюють функціонування глутаматних транспортерів та процес секреції глутамату.

Метою роботи було дослідити активний транспорт глутамату в тромбоцитах. У експериментальній роботі були використані методи: радіоізотопний аналіз (L-[¹⁴C]глутамат), спектрофлуориметрія, конфокальна лазерна скануюча мікроскопія, спектрофотометрія, проточна цитофлуориметрія, газо-рідинна хроматографія, фотонна кореляційна спектрофотометрія, комп’ютерна обробка даних та статистичний аналіз.

Встановлено зниження початкової швидкості високоафінного Na⁺-залежного накопичення глутамату в тромбоцитах при деполяризації плазматичної мембрани, що при довготривалому перебігу може призводити до поступового підвищення концентрації глутамату в плазмі крові та впливати на гомеостаз глутамату в ЦНС. Показано, що на відміну від ізольованих нервових закінчень головного мозку, базальне та транспортер-залежне вивільнення глутамату не характерне для тромбоцитів, що може свідчити про відсутність в тромбоцитах передумов, за яких спостерігається перехід глутаматних транспортерів у реверсний режим функціонування (наявність значного цитозольного пулу глутамату та потенціал-залежних Na⁺-каналів). Доведено, що дегрануляція при активації тромбоцитів ? це єдиний шлях вивільнення глутамату. Пул глутамату в тромбоцитах, який знаходиться в секреторних (щільних) гранулах, підтримується на сталому рівні навіть за умов подальшої дисипації протонного градієнта цих внутрішньоклітинних компартментів і вивільнюється лише при активації тромбоцитів. Виявлено, що блокатор потенціал-залежних К⁺-каналів сімейства Kv1 4-амінопіридин, який є класичним деполяризуючим агентом, викликає вивільнення глутамату з тромбоцитів та синаптосом шляхом екзоцитозу в безкальцієвому середовищі, внаслідок вивільнення Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо.

Встановлено, що акцептор холестеролу метил-b-циклодекстрин (M?CD), який знижує рівень мембранного холестеролу в тромбоцитах, призводить до дисипації протонного градієнта секреторних гранул тромбоцитів, однак здатність тромбоцитів до дегрануляції при цьому зберігається. Вперше показано, що комплекс M?CD-холестерол (1:0,2), який збагачує плазматичну мембрану холестеролом, викликає підвищення протонного градієнта секреторних гранул тромбоцитів. Встановлений у роботі взаємозв’язок між зміною рівня мембранного холестеролу, функціональним станом та транспортом  глутамату в тромбоцитах свідчить, що використання циклодекстринів для спрямованого транспорту гідрофобних лікарських субстанції та застосування інгібіторів синтезу холестеролу (статинів) може знижувати протонних градієнт секреторних гранул тромбоцитів та пригнічувати акумуляцію в них регуляторних сполук, які транспортуються з використанням протонного градієнта.

На основі проведених досліджень припускається, що везикулярні глутаматні транспортери тромбоцитів не переходять у реверсний режим функціонування, і/або ?рН (як складова ??Н⁺ – рушійної сили для роботи везикулярних глутаматних транспортерів) не відіграє суттєвої ролі у підтриманні попередньо акумульованого глутамату в секреторних гранулах.

Порівняльний аналіз процесу активного транспорту глутамату в тромбоцитах та нервових закінченнях головного мозку свідчить про схожість високоафінного Na⁺-залежного накопичення глутамату в обох досліджуваних об’єктах, проте механізми вивільнення глутамату з тромбоцитів та нервових закінчень є різними.