Cучасні методи флуоресцентної мікроскопії
Крупко О., Лабинцев А. Пиршев К.
Методи флуоресцентної мікроскопії надають унікальні можливості для дослідження тонкої структури об’єкту. Фактично, термін “флуоресцентна мікроскопія” відноситься до ряду методичних підходів, що засновані на реєстрації люмінесценції в досліджуваному об’єкті внаслідок поглинання енергії збудження. Безперечною перевагою є той факт, що ці підходи можуть бути застосовані не лише до фіксованих, але й до живих препаратів, що дозволяє вивчати динамічні процеси, які відбуваються в клітині та її структурах в часі з високим просторовим розділенням.
Будуть розглянуті основні принципи конфокальної флуоресцентної мікроскопії, спінінг диск (Spinning disk), TIRF (Total internal reflection fluorescence microscope) та деякі підходи із їх використанням FRET (F?rster resonance energy transfer).Крім зазначених підходів прижиттєвої візуалізації клітин будуть розглянуті принципи сучасних високороздільно-здатних (Нigh resolution) технік PALM (Рhotoactivated localization microscopy), STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy) та STED (Stimulated emission depletion) – витончені технічні рішення, які дозволяють подолати дифракційний ліміт та досягають роздільної здатності 20 нм.
Кожен з цих підходів має свої недоліки і переваги, які слід враховувати при постановці дослідницької задачі. Відповідно, вибір параметрів для конкретного дослідження передбачає базове розуміння цілого ряду як теоретичних, так і суто технічних питань.По перше, флуоресцентна мікроскопія – один з методів світлової мікроскопії, а флуоресцентний мікроскоп – оптичний прилад, отже на нього розповсюджується обмеження притаманні таким приладам. Тому розуміння базових законів оптики є ключем до розуміння принципу побудови зображення у мікроскопі та визначення його роздільної здатності, що є однією з найважливіших характеристик мікроскопа та визначає якість зображення. Хвильова природа світла обумовлює дифракційний ліміт, який накладає обмеження на характеристики оптичних приладів. Границя оптичного розділення мікроскопу залежить від довжини хвилі та характеристик об’єктиву. Основними параметрами об’єктивів є їх числова аппертура і збільшення. Важливі також товщина покривного скла, на яку розраховані об’єктиви, тип іммерсії, робоча відстань, типи оптичної корекції та спектральний діапазон. Також важливо розуміти, що сучасний флуоресцентний мікроскоп – це оптично-електронний прилад, у якому багаторазово відбувається перетворення однієї форми сигналу в іншу, що також впливає на загальну роздільну здатність. Наприклад, мають значення такі параметри як: формат кадру (число пікселів - елементів зображення на кадр) та електронне збільшення. Максимальний розмір пікселів, при якому ще не відбувається втрати оптичного розділення, визначається критерієм Найквіста.
Крім, власне, оптичних характеристик приладу для проведення якісного дослідження на живих клітинах необхідно забезпечити відповідні умови для підтримання їх життєдіяльності та закріплення на підложці. Цей пункт включає власне вибір типу підложки, контроль температури, вологості, рН, вибір відповідного флуорохрому та інтенсивності флуоресцентного освітлення.