Шановні колеги, вітаю Вас! В Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України 9-го квітня (вівторок) 2013 р. о 10-30 в Актовій залі відбудеться чергове засідання наукового семінару «Актуальні питання сучасної біохімії». Будемо слухати доповідь Зажицької Маріанни Олегівни (Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної та молекулярної генетики), тема: «МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ ТРЕКУ ДНК ПРИ КОМЕТНОМУ ЕЛЕКТРОФОРЕЗІ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН». Традиційно до цього листа додаємо файл із авторськими тезами доповіді. Будемо раді зустрітися з Вами та Вашими колегами на засіданні нашого семінару. З повагою – С.О.Костерін.
Зажицька Маріанна Олегівна
МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ ТРЕКУ ДНК ПРИ КОМЕТНОМУ ЕЛЕКТРОФОРЕЗІ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної та молекулярної генетики
У роботі представлено експериментальні результати про механізми формування треку ДНК під час електрофорезу ізольованих клітин (кометного електрофорезу). На відміну від стандартного протоколу (який передбачає проведення електрофорезу протягом фіксованого часу), досліджувалась кінетика формування комет. Кінетична залежність для відносного вмісту ДНК у хвостах комет для інтактних клітин є двофазною: на першому етапі швидко виходить незначна кількість ДНК («швидка компонента»), після чого спостерігається затриманий S-подібний вихід її основної частини («повільна компонента») і досягається плато. Таким чином, непошкоджені клітини формують трек ДНК за довготривалого впливу електричного поля. Було зроблено припущення, що перше плато формується невеликою кількістю "швидких петель", які містять однониткові розриви. Можна припустити, що на пізніх хвилинах електрофорезу саме надспіралізовані петлі формують хвости комет, для чого потрібна достатньо довготривала дія електричного поля (зовнішньої розтягувальної сили). Такі петлі змушені долати окрім опору агарози, власний еластичний опір. Дана інтерпретація підтверджується спостереженням, що вихід ДНК у хвіст комети є оборотним після виключення електрофорезу.
Отримані результати вказують, що формування хвоста комети в інтактних клітинах утруднюється через наявність торсійної напруги в молекулі ДНК. Одним із шляхів зняття негативної надспіралізації без порушення цілісності циркулярної ДНК є локальна розкрутка подвійної спіралі за рахунок інтеркаляції гетероциклічних сполук. Отже, можна очікувати пришвидшення формування комет за певних концентрацій інтеркаляторів. У нашій роботі ми використовували два інтеркалятори: бромистий етидій та хлорокін, які взаємодіючи з циркулярною ДНК, її розкручують, вносячи тим самим позитивну надспіралізацію. Суттєве пришвидшення виходу ДНК, яке спостерігалося за низьких концентрацій інтеркаляторів, пов’язане з компенсацією наявної в петельних доменах негативної надспіралізації, тобто призводить до релаксації петель ДНК. Оскільки петельні домени ДНК релаксовані за низьких концентрацій інтеркаляторів, оборотність виходу ДНК не спостерігалася: як і передбачалося, цей ефект не властивий для релаксованих за рахунок інтеркаляції петельних доменів ДНК.
Збільшення концентрації інтеркалятора супроводжується накопиченням надспіралізації вже позитивного знаку, що знову гальмує формування треку ДНК при електрофорезі. При цьому спостерігали ефективну оборотність: чим вищою була концентрація інтеркаляторів, тим швидше зменшувалась кількість ДНК у хвостах комет.
Щоб з’ясувати ефект, власне, інтеркаляції (а не пов’язаних з нею топологічних ефектів), було проведено ряд експериментів, у яких нуклеоїди піддавались опроміненню дозами, які здатні вносити приблизно 1 однонитковий розрив на петлю, знімаючи тим самим топологічні обмеження. Порівняння кінетики формування комет в опромінених клітинах та інтактних клітинах низької концентрації бромистого етидію показує, що, хоча в обох випадках ми маємо справу з релаксованими петлями, ДНК опромінених клітин виходить швидше. Кінетика формування треку ДНК в опромінених клітинах в присутності бромистого етидію пояснює цю розбіжність: збільшення концентрації інтеркалятора призводить до поступового утруднення формування комет. Але заряд інтеркалятора дає вклад тільки в гальмування виходу, а не в зниження максимально можливого виходу ДНК.
Для пояснення цього ефекту було проведено ряд експериментів, у яких проводили лужну денатурацію перед нейтральним електрофорезом. Після такої обробки вихід ДНК не спостерігався взагалі, хоча після такої ж обробки з подальшим лужним електрофорезом спостерігали ефективне формування комет. Подібний, але більш м’який ефект спостерігається при високих концентраціях інтеркаляторів, які можуть сприяти дисоціації ДНК від білків ядерного матриксу. Відсутність виходу ДНК в експериментах по денатурації ДНК і подальшої її нейтралізації можна пояснити тотальним розкручуванням ДНК, в результаті чого петлі втрачаються зв’язок з ядерним матриксом і кожна хромосома являє собою довгу молекулу ДНК, незакріплену в багатьох точках на білках матриксу. Така молекула намагається мігрувати єдиним фронтом, але не може цього зробити внаслідок великого розміру. У випадку інтеркаляторів ми, напевно, маємо справу з дисоціацією петель ДНК від білків матриксу за рахунок локального розкручування подвійної спіралі в сайтах їх взаємодії. Така дисоціація призводить до збільшення розмірів петельних доменів, і, як наслідок, унеможливлення їхнього виходу у хвіст комети.
Отримані результати дозволили нам зробити висновок про природу ДНК, яка міститься у хвості комети: у випадку інтактних клітин хвіст утворюється петлями ДНК, закріпленими на білках ядерного матриксу; під час лужного електрофорезу одноланцюгові фрагменти ДНК мігрують у хвіст комети. Крім того, результати дають уявлення про механізми формування самих петельних доменів - можливо, за рахунок топологічного зв’язку.