Гойстер Оксана Станіславівна
пров. інженер відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
РОЗРОБКА ЕКСПРЕСНИХ МЕТОДІВ БІОТЕСТУВАННЯ Т-2 ТОКСИНУ.
Т-2 токсин є метаболітом грибів роду Fusarium, які вражають за сприятливих умов зернові культури, роблячи їх небезпечними для людей і тварин. Сучасні методи аналізу дозволяють виявляти мікотоксини в біологічних зразках та об’єктах навколишнього середовища з високою точністю та вибірковістю, але є громіздкими, дорогими та потребують для їх використання висококваліфікованого персоналу. Поєднання біологічних інструментальних методів аналізу загальної токсичності Т-2 токсину в об’єктах навколишнього середовища з високочутливим та експресним біосенсорним визначенням є дуже актуальним для швидкої оцінки наявності Т-2 токсину.
Метою даної роботи була розробка нових методів визначення Т-2 токсину за допомогою оптичних сенсорів та аналітичних інструментальних біотестів на основі активованої хемілюмінесценції екзометаболітів дафній та бактеріальної біолюмінесценції.
В роботі застосували такі методи дослідження, як хімічний синтез кон'югатів, поверхнево-плазмонний резонансний аналіз (ППР), еліпсометричний аналіз (ЕПВВ), хемілюмінесцентний і біолюмінесцентний аналіз, імуноферментний аналіз (ELISA), статистичний аналіз.
Вперше розроблено аналітичні біотести для визначення Т-2 токсину на основі використання активованої хемілюмінесценції екзометаболітів середовища існування дафній та бактеріальної біолюмінесценції. Вперше запропоновано алгоритми кількісного визначення Т-2 токсину за допомогою ППР імуносенсора, а саме з виконанням „прямого” і „конкурентного” аналізів. Відпрацьовано оптимальні варіанти модифікації поверхні трансдуктора для підвищення чутливості і стабільності відгуку імунного біосенсора на основі ППР з використанням поліклональних та моноклональних антитіл. Продемонстровано ефективність використання штучних каліксаренових рецепторів, як селективних молекул, для визначення Т-2 токсину за допомогою сенсора ППР. Проаналізовано залежність величини відгуку ППР сенсору від хімічної будови каліксаренів. Вперше показана можливість визначення Т-2 токсину в дуже низьких концентраціях з використанням прямого імунного аналізу методом еліпсометрії повного внутрішнього відбиття.
Проведеними дослідженнями показана можливість застосування методу збудженої хемілюмінесценції екзометаболітів середовища культивування дафній для визначення Т-2 токсину з межею виявлення 0,1 мкг/мл. Розроблено алгоритм короткотривалого 2-годинного хемілюмінесцентного аналізу. Середня летальна концентрація Т-2 токсину по смертності складає 0,07 мг/л. Встановлено, що у короткотривалих дослідах 50%-е інгібування біолюмінесценції настає при концентрації 12 мкг/мл, у довготривалих експериментах – 18 мкг/мл. Тривалість тестування становить 10 хвилин і 16 годин, відповідно. Мінімальна діюча концентрація Т-2 токсину в біолюмінесцентному тесті складає 2,5 мкг/мл. Запропоновано два варіанти визначення Т-2 токсину за допомогою імуносенсора: „прямий” аналіз, що забезпечує граничну межу виявлення сенсора на рівні 20 нг/мл, та „конкурентний” - 1 нг/мл. Застосування модифікації поверхні додекантіолом у випадку „прямого” аналізу дає змогу досягти межі визначення сенсора на рівні 5 нг/мл, поліелектролітом – 2 нг/мл, як у випадку використання полі- так і моноклональних антитіл. Показано ефективність іммобілізації Т-2 токсину на додекантіолмодефіковану поверхню ППР-сенсору з використанням штучних каліксаренових рецепторів. Межа виявлення мікотоксину у водних розчинах становить 1,2 нг/мл. Відпрацьовано оптимальні умови визначення Т-2 токсину за допомогою біосенсора на основі еліпсометрії повного внутрішнього відбиття за допомогою “прямого” імунного аналізу з граничною межею виявлення 0,15 нг/мл.