Шановні колеги, вітаю Вас! В Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України 21-го травня (вівторок) 2013 р. о 10-30 в Актовій залі відбудеться чергове засідання наукового семінару «Актуальні питання сучасної біохімії». Будемо слухати доповідь Гуменюка Віталія (відділ нейрохімії Інституту біохімії НАН України) <Вплив зменшення вмісту холестеролу в мембранних структурах синаптосом на гомо- та гетеротипне злиття мембран». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Як завжди, до цього листа додаємо файл із авторськими тезами доповіді. Будемо раді зустрітися з Вами та Вашими колегами на засіданні нашого семінару. З повагою – С.О.Костерін.
Вплив зменшення вмісту холестеролу в мембранних структурах синаптосом на гомо- та гетеротипне злиття мембран
Гуменюк Віталій
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ нейрохімії
Забезпечення ефективної передачі сигналу потребує злагодженої дії протеїнових та ліпідних компонентів нейронів. В секреторних клітинах протеїни, що зв’язані з мембраною, зокрема SNARE, локалізовані в ліпідних мікродоменах, які збагачені на холестерол та сфінголіпіди і функціонують як динамічні утворення, що мають регуляторний вплив на процес нейросекреції.
Метою роботи було дослідити, як впливає зміна рівню холестеролу в мембранних структурах синаптосом головного мозку щурів на агрегацію ізольованих синаптичних везикул, їх Са2+- ініційоване злиття з плазматичними мембранами синаптосом або між собою.
За використанням безклітинної модельної системи було відтворено та ідентифіковано два етапи процесу екзоцитозу: агрегація синаптичних везикул (без злиття їх мембран), що імітує in vitro етап докінгу; кальцій-ініційоване злиття синаптичних везикул з плазматичними мембранами синаптосом (злиття гетеротипних мембран) або синаптичних везикул між собою (злиття гомотипних мембран).
Вміст холестеролу в мембранних структурах синаптосом (фракції синаптичних везикул та плазматичних мембран нервових закінчень) змінювали за допомогою агенту метил-?-циклодекстрину (МЦД). Показано, що рівень вилучення холестеролу з мембранних структур синаптосом зростає зі збільшенням концентрації агенту МЦД. Процес видалення холестеролу також залежить від температури середовища та часу інкубації.
Методом лазерно-кореляційної спектроскопії виявлено, що концентрація протеїнів цитозольної фракції синаптосом має важливе значення для формування кластерів синаптичних везикул та їх стабільності. Згідно отриманих результатів ми припускаємо, що агрегований стан синаптичних везикул являє собою проміжну ланку процесу екзоцитозу, яка передує Са2+-залежному злиттю мембран. Показано, що зменшення вмісту холестеролу в мембрані синаптичних везикул на ~25% не впливає на процес їх кластеризації (докінгу).
Було досліджено вплив зменшення вмісту холестеролу в мембранних структурах синаптосом на кальцій-стимульоване злиття гомо- та гетеротипних мембран, яке оцінювали по зміні інтенсивності флуоресценції зонду R18. Виявилось, що кінетика Са2+-стимульованого злиття синаптичних везикул з плазматичними мембранами синаптосом із зменшеним вмістом холестеролу сповільнюється, що обумовлено порушенням функції протеїнів, які опосередковують цей процес. При зменшенні кількості холестеролу в плазматичній мембрані понад 25 %, рівень їх злиття із синаптичними везикулами не різнився від контролю. Тобто, нами показано, що є певна межа концентрації холестеролу в плазматичній мембрані, коли його зменшення призводить до інгібування процесу злиття гетеротипних мембран. Ми припускаємо, що видалення більше 25 % холестеролу з мембрани викликає підвищення плинності ліпідного бішару, що посилює здатність мембран до злиття, і, таким чином, нівелюється інгібування злиття мембран, що забезпечується протеїнами, чутливими до холестеролу.
Дослідження процесу злиття синаптичних везикул між собою у відповідь на додавання Са2+ або/та Mg2+-AТФ вказує про можливість моделювання складного екзоцитозу в безклітинній системі, що дозволило нам першими застосувати вираз „злиття гомотипних мембран синаптичних везикул”. Зазначимо, що вміст холестеролу в мембрані синаптичних везикул на 30 % більший ніж у плазмалемі нейронів. Виявилось, що за умови вилучення ~20 % та ~40 % холестеролу з синаптичних везикул кінетика кальцій-стимулюваного злиття гомотипних мембран уповільнюється.
Відмітимо, що для моделювання етапів екзоцитозу у безклітинних системах були використані фракції синаптичних везикул, плазматичних мембран та протеїнів цитозолю, які виділяли із лізованих синаптосом головного мозку щурів. Препарат інтактних синаптосом використовували для вивчення впливу зменшення холестеролу на процес стимульованого вивільнення нейромедіатору. Виявилось, що за умови обробки суспензії синаптосом 15 мМ МЦД процес індукованого кальцієм вивільнення L-[14C] глутамату зменшується на 32 %. Таким чином, холестерол є важливою компонентою мембрани нервових терміналей, зміна вмісту якого призводить до порушення процесу нейросекреції.
Для підтримання рівноваги між процесами нейронального збудження та гальмування застосовують антиепілептичні препарати. Більшість антиепілептичних препаратів можуть діяти одночасно за декількома механізмами: впливають на різні медіаторні системи, рецептори та іонні канали. Цілком логічно було використати для тестування дії антиепілептичних препаратів розроблені нами безклітинні модельні системи. Було виявлено, що етосуксимід, вальпроат натрію та габапентин активують кальцій-стимульоване злиття гомо- та гетеротипних мембран. Тобто, нами вперше було продемонстровано, що досліджувані антиепілептичні препарати проявляють свою дію на етапі злиття синаптичних везикул з мембранами-мішенями.
В експериментах, де були використані синаптичні везикули зі зменшеним вмістом холестеролу було показано, що етосуксимід, вальпроат натрію та габапентин зберігають здатність підвищувати інтенсивність їх кальцій-індукованого злиття. Таким чином, є підстава вважати, що досліджувані антиепілептичні препарати діють через протеїни, які локалізовані поза межами мікродоменів мембрани, які збагачені на холестерол. Отже, вилучення холестеролу з мембран не впливало на здатність антиепілептичних препаратів проявляти активуючу дію на злиття синаптичних везикул.
Для збільшення рівню холестеролу в плазматичних мембранах синаптосом був застосований комплекс МЦД : холестерол у молярному співвідношенні 8 : 1. Нами було виявлено, що за умов підвищення в плазматичних мембранах синаптосом рівню холестеролу на 30 % спостерігається уповільнення кінетики кальцій-стимульованого злиття мембран в безклітинній системі.
Нами вперше було використано флуоресцентне похідне холестеролу (родамін-холестерол), яке вбудовували в мембрану клітин нейробластоми миші у комплексі з МЦД. Використання конфокальної мікроскопії дозволило візуалізувати мембрану клітин нейробластоми миші без порушення її структури.
Серед багатьох патофізіологічних змін, що відбуваються при діабеті 1 типу є підвищення вмісту холестеролу в плазмі крові та в мембранах еритроцитів. Нами було встановлено, що за цієї патології кількість холестеролу в мембрані синаптосом також збільшується. Схожий результат було отримано при визначенні концентрації холестеролу в мембранах синаптосом, ізольованих з головного мозку щурів, що зазнавали експериментального D3 гіповітамінозу. При цьому виявлено, що рівень стимульованого кальцієм злиття мембранних структур ізольованих з мозку щурів хворих на діабет 1 типу або D3 гіповітаміноз знижувався у порівнянні з контролем.
Одержані дані вказують, що концентрація холестеролу в плазмалемі нейронів та в синаптичних везикулах є важливим фактором регулювання функції мембранних протеїнів, що забезпечують ефективність синаптичної передачі.