УДК 577.218+616-006
А. БАЗАЛІЙ1, О. ВОРОТНІКОВ2, Л. ДРОБОТ 1
КОНСТРУЮВАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ПЛАЗМІДНИХ ВЕКТОРІВ ДЛЯ ЕКСПРЕСІЇ В КЛІТИНАХ ССАВЦІВ, ЩО КОДУЮТЬ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИЙ БІОСЕНСОР ДО ПЕРОКСИДУ ВОДНЮ HyPer ТА ЗЛИТИЙ ПРОТЕЇН Ruk/CIN85-HyPer
1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ;
2Факультет фундаментальної медицини, МДУ ім. М. В. Ломоносова, Росія;
e-mail:
На сьогодні, з використанням внутрішньоклітинного біосенсора до пероксиду водню HyPer, продемонстровано, що активація тирозинкіназних рецепторів призводить до тривалого підвищення внутрішньоклітинного рівня пероксиду водню, яке залежить від активації НАДФН-оксидази. При цьому, кінетика і динаміка рецептор-залежного пероксидного сигналу різко відрізняються від таких при дифузії пероксиду в клітину ззовні. За результатами наших попередніх досліджень адаптерний протеїн Ruk/CIN85 утворює внутрішньоклітинний комплекс з Tks4, який є організатором НАДФН-оксидазного комплексу, опосередкованого NOX1. Для з’ясування потенційної ролі Ruk/CIN85 у функціонуванні НАДФН-оксидазного комплексу і залежної від продукування Н2О2 реалізації довготривалих клітинних відповідей було поставлено завдання сконструювати плазмідні вектори для експресії в клітинах ссавців, що кодують внутрішньоклітинний біосенсор до пероксиду водню HyPer та злитий протеїн Ruk/CIN85-HyPer.
З цією метою було здійснено субклонування послідовності, що кодує HyPer, замість GFP, у плазміду pEGFP-N1 за центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції BamHI і NotI. Як матрицю для отримання послідовності HyPer ПЛР, фланкованої відповідними центрами рестрикції, було використано плазміду PH-Btk-HyPer-MigR1, яка кодує HyPer, кон’югований із PH-доменом цитоплазматичної тирозинкінази Btk. На наступному етапі було здійснено субклонування у вектор експресії HyPer-N1 послідовності, що кодує адаптерний протеїн Ruk/CIN85 таким чином, щоб Ruk/CIN85 був на N-кінці HyPer і між ними розташовувалась невелика лінкерна послідовність. Послідовність Ruk/CIN85 субклонували за центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції XhoI і EcoRI. Як матрицю для отримання цієї послідовності ПЛР було використано плазміду pRc/CMV2-Rukl-nontag. За даними Вестерн-блот аналізу і конфокальної мікроскопії було показано, що рекомбінантні протеїни HyPer та Ruk-HyPer коректно еспресуються в клітинах НЕК293. Зокрема, для HyPer характерним є рівномірне дифузне барвлення як цитоплазми, так і ядра, тоді як Ruk-HyPer зосереджений переважно у ендосомоподібних структурах. Отримані плазміди були використані для отримання субліній аденокарциномних клітин молочної залози людини MCF-7 зі стабільною надекспресією флуоресцентних протеїнів. За допомогою прижиттєвої мікроскопії (мікроскоп LeicaTCS SP5) нами було виявлено співлокалізацію адаптерного протеїну Ruk/CIN85 та утворення пероксиду водню у ендосомо-подібних структурах клітин MCF-7.
Отримані дані свідчать про потенційну роль адаптерного протеїну Ruk/CIN85 у функціонуванні НАДФН-оксидазного комплексу клітин MCF-7.
УДК 577.161.1:591.436
І.О. ШМАРАКОВ, В.Л. БОРЩОВЕЦЬКА, М.М. МАРЧЕНКО
МОДУЛЯЦІЯ РЕТИНОЇДАМИ ТІОАЦЕТАМІД-ІНДУКОВАНОЇ ГЕПАТОТОКСИЧНОСТІ
Кафедра біохімії та біотехнології, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, м. Чернівці;
Пошкодження печінки на клітинному рівні проявляються некрозом гепатоцитів, інфільтрацією паренхіми нейтрофілами та активацією стелатних клітин печінки з одночасною втратою ними ретиноїд-вмісних ліпідних крапель. Виявляється не зовсім зрозумілою метаболічна роль гідролізу ретиніл ефірів ліпідних крапель при активації стелатних клітин, яка супроводжує розвиток фіброзу та цирозу печінки, гепатоклітинного раку, печінкової енцефалопатії. Відкритим залишається питання функціонального навантаження вивільнених ретиноїдів – виконання протективних функцій чи поглиблення патологічного процесу. Мета роботи – встановити роль ретиноїдів в процесах гострого токсичного ураження печінки. Для встановлення внеску ретиніл ефірів активованих стелатних клітин у розвиток гепатотоксичності використано мишей, позбавлених запасів ретиноїдів у печінці внаслідок нокауту гена лецитин:ретинолацилтрансферази, ЕС 2.3.1.135 (Lrat-/-).
Одноразове перитонеальне введення 500 мг/кг тіоацетаміду (ТАА) тваринам дикого типу, призводило до розвитку токсичного ураження печінки через 48 год, що проявлялося появою зон вогнищевого некрозу, зростанням АлАТ активності у сироватці крові і мієлопероксидазної активності в паренхімі печінки на 2 порядки. Одночасно розвивались ознаки печінкової енцефалопатії, виражені у зростанні рівня аміаку у сироватці крові на 25% та зменшенні рівня глюкози в 3 рази. Разом з тим у тварин Lrat-/- ознаки токсичного ураження печінки і печінкової енцефалопатії не виявлялися. Гепатотоксичність ТАА пов’язана із його біоактивацією монооксигеназною системою до сульфоксиду (TASO) та діоксиду (TASO2), які за прооксидантним вільнорадикальним механізмом призводять до утворення адуктів біополімерів. Враховуючи транскрипційну регуляцію активності цитохромів Р450 ядерними рецепторами ретиноєвих кислот (RAR, RXR), цілком очевидно, що відсутність запасів ретиноїдів в печінці Lrat-/- негативно відображається на функціонуванні монооксигеназної системи. З огляду на встановлену нами низьку гідроксилазну та оксигеназну активності у мікросомній фракції печінки, відсутність гепатотоксичності ТАА пояснюється неможливістю його біоактивації. Це підтверджується також незмінним рівнем відновленого глутатіону у тварин Lrat-/-, в той час як у мишей дикого типу даний показник знижувався на 60%. Для підтвердження залежності гепатотоксичності ТАА від наявності ретиноїдів нами проводилось пероральне введення тваринам 3000 МО вітаміну А, що викликало розвиток фенотипу гострої гепатотоксичності у мишей Lrat-/ та його посилення у мишей дикого типу. Отже, нами показано, що вивільнені при активації стелатних клітин печінки ретиноїди необхідні для реалізації гепатотоксичного ефекту ТАА.
УДК 577.27:616.097
О.В. ГАЛКІН, О.С. ОЛІЙНИК
ПІДВИЩЕННЯ ПРОДУКТІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ scFv-АНТИТІЛ ТА СПРОЩЕННЯ ЇХ ДЕТЕКЦІЇ В ІМУНОАНАЛІЗІ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна, Київ;
ВСТУП: Широко використовуваним форматом рекомбінантних антитіл є одноланцюгові варіабельні фрагменти – scFv (single-chain fragment variable). scFv застосовуються як високоспецифічні імунологічні реагенти, для виділення і встановлення характеристик біомолекул, в терапевтичних та діагностичних цілях. Хоча клітини E. coli є основною експресійною системою для одержання scFv-антитіл, існує ряд проблем, які зумовлюють низький рівень продукції scFv-антитіл у E. coli або їх синтез у функціонально неактивній формі. Метою цієї роботи було дослідити влив D-E-A-A* фрагменту стафілококового білка А у складі злитого протеїну з scFv-антитілами на ефективність їх продукції у клітинах E. coli.
МЕТОДИ: В роботі використано методи роботи з рекомбінантними ДНК, металоафінної хроматографії, електрофорезу в поліакриламідному та агарозному гелі, імуноферментного аналізу, імуноблотингу.
РЕЗУЛЬТАТИ: Було одержано універсальну генетичну конструкцію на основі вектора pET-28c для продукції scFv-антитіл, об’єднаних з білком А. На прикладі scFv-антитіл різного походження і специфічності (scFv-1E до екстрацелюлярного домену ?7 субодиниці нікотинового ацетилхолінового рецептора, отримані з бібліотеки scFv-антитіл людини, та отримані з бібліотек антитіл миші scFv-7E до ростового фактору HB-EGF, і scFv-II-15 до субодиниці B дифтерійного токсину) показано, що рівень їх продукції у злитій із білком А формі значно перевищує рівень продукції вільних scFv у аналогічній експресійній системі.
Методом імуноферментного аналізу було показано, що отримані scFv-антитіла, злиті з фрагментом гену білка А, розпізнавали цільові та не розпізнавали контрольні антигени. Це підтверджує збереження scFv-антитілами у складі злитого білка антиген-зв’язувальної функції. Також було показано, що злиті білки розпізнавалися кон’югованими з пероксидазою поліклональними антитілами кроля, специфічними до імуноглобулінів миші. Тобто, у складі злитого протеїну білок А зберігав здатність зв’язувати імуноглобуліни, а отже, для детекції злитих з білком А scFv можуть застосовуватися мічені імуноглобуліни довільної специфічності, що значно спрощує виявлення scFv-антитіл та їх комплексів з антигеном.
ВИСНОВКИ: Однією з найактуальніших проблем сучасного біотехнологічного виробництва рекомбінантних антитіл залишається розробка недорогих і ефективних систем експресії генів scFv, а також впровадження технологічних методів виділення цільового продукту в очищеному і біологічно активному стані. Стратегія, яка запропонована у даній роботі, може використовуватись як універсальний і дієвий підхід для підвищення ефективності продукції scFv-антитіл в клітинах E.coli. При цьому фрагмент білка А виступає не лише ф’южен-партнером, що ефективно підвищує рівень продукції scFv-антитіл, а також є зручним тегом для їх детекції та очищення. Одержані ф’южени scFv-антитіл з білком А можуть бути в подальшому використані для детекції та досліджування відповідних антигенів.
УДК 577.218+616-006
Д.C. ГЕРАЩЕНКО1,2, Г.В. ПАСІЧНИК1,2, Н.Д. ШАБАС 1,2, Д.Н. ПЕТУХОВ 2, А.В. БАЗАЛІЙ 2, А.А. САМОЙЛЕНКО 2, Н.В. БИЦЬ2, Л.Б. ДРОБОТ 2
ЗНИЖЕННЯ РІВНЯ ЕКСПРЕСІЇ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ Ruk/CIN85 В КЛІТИНАХ КАРЦИНОМИ ЛЕГЕНІ ЛЬЮЇСА (LLC) ПРИЗВОДИТЬ ДО ПОСИЛЕННЯ РОСТУ ПУХЛИН ТА МЕТАСТАЗУВАННЯ in vivo
1Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ
Незважаючи на високий ступінь гетерогенності механізмів виникнення і прогресії злоякісних новоутворень у всьому світі не припиняється пошук як нових пухлиноспецифічних маркерів, так і внутрішньоклітинних мішеней для скерованого впливу на біологію пухлинних клітин. Це пов’язано, насамперед, з тим, що регуляторні механізми клітин організовані за мережевим принципом, і, діючи скеровано на їх ключові компоненти, вдається регулювати фізіологію клітин в обхід генетичних змін, що викликали розвиток тих чи інших патологічних станів. За результатами наших попередніх досліджень адаптерний протеїн Ruk/CIN85 вносить вклад до посилення малігнізації слабко інвазивних аденокарциномних клітин молочної залози людини лінії MCF-7. Метою даної роботи було отримання субліній клітин карциноми легені Льюїса зі стабільним пригніченням експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 за допомогою siRNA-інтерференції та подальшим аналізом швидкості росту пухлин і метастазування на моделі in vivo.
За допомогою Вестерн-блот аналізу з використанням специфічних анті-Ruk/CIN85 антитіл було встановлено відносно високий рівень експресії адаптерного протеїну в клітинах карциноми легень Льюїса LLC. Для зниження рівня Ruk/CIN85, клітини LLC було інфіковано Ruk/CIN85-специфічним shRNA-лентивірусом з подальшою селекцією за присутності пуроміцину (10 мкг/мл, протягом 3 тижнів). За даними MTT-тесту, зниження рівня Ruk/CIN85 в клітинах LLC призвело до близько 30% підвищення проліферативної активності in vitro, підвищення швидкості росту пухлин після короткого латентного періоду, 30% збільшення об’єму та ваги пухлин та двократного збільшення кількості метастазів in vivo.
Отримані дані свідчать, що зниження рівня експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 в клітинах карциноми легені Льюїса лінії LLC призводить до посилення їх трансформувального потенціалу.
УДК 615.256; 615.3
І.В. ГЕРАЩЕНКО
ПОХІДНІ ІМІДАЗО[1,2-а]АЗЕПІНІЮ, ЯК ПОТЕНЦІАЛЬНІ ТОКОЛІТИКИ
ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМН України», Київ;
Вступ. Сьогодні є актуальною проблема передчасних пологів, що у розрізі важкої демографічної ситуації у багатьох країнах вимагає збереження кожної вагітності. Найчастіше в нашій країні лікарі вдаються до токолітичної терапії, використовуючи при цьому препарати різних фармакологічних груп: блокатори окситоцинових рецепторів, блокатори кальцієвих каналів, інгібітори фосфодіестерази, препарати магнію та ін. Нажаль, жоден препарат із зазначених груп не характеризується одночасно як безпечністю, так і ефективністю, тому лікарі завжди ризикують вдаючись до токолітичної терапії. Ми вважаємо, що пошук нового та селективного за своєю дією токолітичного препарату є актуальним та необхідним для нашої країни.
Методи. В роботі були використані наступні методи: комп’ютерне прогнозування біологічної активності (PASS – Prediction of Activity for Substanses), фізіологічні (міографічні дослідження скоротливої активності ізольованих поздовжніх смужок рогів матки щурів, дослідження внутрішньо маткового та артеріального тиску в умовах in vivo).
Результати. Першим етапом нашої роботи було створення віртуальної бібліотеки, систематизованої за допомогою пакета ISIS 2.4. Біологічну активність кожної структури перевірили через програму PASS та проаналізували кількість прогнозованих активностей, а також враховували процент ймовірності прогнозованої активності, обрані оптимальні структури-лідери, яким була прогнозована токолітична активність безпосередньо, або ж за механізмом дії, були синтезовані для подальших досліджень. За результатами сринінгових досліджень на токолітичну активність похідних імідазо[1,2-а]азепінію було виявлено сполуки, які ефективно знижували тонус (IFT_000200 на 74 %, IFT_000176 на 53 %, IFT_000208 на 33,8%, ), амплітуду (IFT_000208 на 26,8%, IFT_000178 на 14 %) та збільшували час фази скорочення (IFT_000177 в два рази) і розслаблення (подовжували на 25-90% 9 досліджуваних сполук), інтервал між матковими скороченнями (в 9,5 разів збільшувала структура IFT_000208). Сполуки лідери, обрані за результатами скринінгових досліджень, перевірено на моделі in vivo та визначено їх вплив на рівень артеріального й внутрішньо маткового тиску (гострий експеримент in vivo на щурах самицях, що народжували, з використанням уретанового наркозу в дозі 1,5 г/кг, за умов одночасної реєстрації вимірюваних показників) .
Висновки. Теоретичне обґрунтування цілеспрямованого синтезу сполук з токолітичною активністю сприяє зменшенню економічних затрат для скринінгових досліджень, дозволяє розширити можливості аналізу одержаних результатів та створює передумови для моделювання хімічної структури з прогнозованою необхідною біологічною активністю.
УДК 577.352.38:577.64
Л.Л. ГНАТИШИНА, О.Й. ОСАДЧУК, О.О. ТУРТА, Г.І. ФАЛЬФУШИНСЬКА, О.Б. СТОЛЯР
МОЛЕКУЛЯРНІ СИСТЕМИ ВІДПОВІДІ НА СТРЕС ТА ДЕТОКСИКАЦІЇ У ДВОСТУЛКОВОГО МОЛЮСКА ЗА ВПЛИВУ НОВІТНІХ ЗАБРУДНЮВАЧІВ ДОВКІЛЛЯ
Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка, Тернопіль;
Засоби особистої гігієни та фармацевтичні препарати (ЗОГФП), а також їх метаболіти відносяться до потенційно найбільш небезпечних новітніх забруднювачів, які можуть чинити токсичну дію вже в наномолярних концентраціях та важко піддаються виявленню у середовищі. Це зумовлює необхідність визначення ефекту їх дії на нецільові організми та пошуку експрес-методів їх детекції. Тому метою нашої роботи було вивчити стан стресочутливих систем двостулкового молюска Unio tumidus за дії широко розповсюджених ЗОГФП в екологічно реальних концентраціях та встановити відповідність реакції організму до дії комплексного природного забруднення та експериментальних чинників. Молюски – організми, що володіють здатністю акумулювати речовини з водного оточення, були обрані для дослідження як альтернативна модель для прогнозування ефекту пошкоджуючих речовин для людини. Чоловічих особин молюсків утримували в акваріумах протягом 14 діб з підвищеним вмістом антимікробного препарату триклозану (5-хлоро-2-(2,4-дихлорофеноксі)-фенол, 500 нг/л), нестероїдного протизапального засобу ібупрофену (250 нг/л) та ксеноестрогену естрону (100 нг/л). Досліджували також молюсків із забрудненої водойми.
За дії всіх модельних чинників у тварин було відзначено ознаки оксидативного стресу (збільшення рівня ліпофусцину, карбонільних похідних білків та окисненого глутатіону у травній залозі), пригнічення аеробного метаболізму (збільшення співвідношення лактат/піруват) та генотоксичності (збільшення кількості гемоцитів з мікроядрами та розривів ланцюгів ДНК, за винятком дії ібупрофену). Зокрема, за дії ібупрофену та триклозану активується глутатіон-трансфераза та зменшується вміст стресочутливих білків металотіонеїнів, за дії ібупрофену та природного комплексного забруднення збільшується, а за дії естрону зменшується рівень вітелогенін-подібних білків. Також було відзначено активацію апоптозу у молюсків за дії естрону та природного забруднення.
Аналіз даних методом багатоваріантної статистики дозволив виявити подібність реакції молюсків контрольної групи та за дії ібупрофену, а також естрону та природного комплексного забруднення, а також відмінний її характер у тварин за дії триклозану відповідно до загального пригнічення стресочутливих систем. За допомогою побудови класифікаційного дерева доведено, що рівень ліпофусцину, окисненого глутатіону та активність каспази-3 належать до головних класифікаційних ознак досліджуваних груп. Відповідь молюсків на вплив природного комплексного забруднення найбільш подібна до дії естрону.
Отже, одержані дані свідчать про високу чутливість та селективність молюсків до присутності новітніх забруднювачів в екологічно реальних концентраціях. Встановлений мінімальний набір показників може бути використаний для прогнозування біоризиків довкілля. Запропоновано новий біохімічний механізм для пояснення взаємозабезпечення іонами цинку металотіонеїнів та вітелогенін-подібних білків.
Робота виконана за підтримки МОН (№118Б).
УДК 577.352 : 615.213
В.П. ГУМЕНЮК, І.О. ТРИКАШ
ЛЕВІРАЦИТАМ ЯК ІНСТРУМЕНТ ДЛЯ ВИВЧЕННЯ РОЛІ БІЛКУ СИНАПТИЧНИХ ВЕЗИКУЛ SV2A В РЕГУЛЯЦІЇ ПРОЦЕСУ ЕКЗОЦИТОЗУ in vitro
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ
Вступ. Місцем специфічного зв'язування антиепілептичного препарату леветірацетаму є глікопротеїн синаптичних везикул SV2A, функція якого пов'язана з регуляцією процесу нейросекреції в синапсі. Метою дослідження було вивчення впливу антиепілептичного препарату леветірацетаму на процеси агрегації синаптичних везикул та їх кальцій-індукованого злиття з мембранами-мішенями у безклітинних моделях нейросекреції.
Методи. Розмір синаптичних везикул та їх агрегатів в суспензії вимірювали методом лазерно-кореляційної спектроскопії. Злиття мембранних структур кількісно визначали по зміні величини самогасіння флуоресценції зонду октадецил родамін Б хлориду (R18).
Результати. Ефект леветірацетаму на функціонування синаптичних везикул розглядається нами як наслідок його унікальної властивості взаємодіяти з інтегральним протеїном синаптичних везикул SV2A. Було виявлено, що леветірацетам стимулює агрегацію або кластеризацію синаптичних везикул в безклітинній системі. Таким чином, можна вважати, що протеїн синаптичних везикул SV2A задіяний в регуляції взаємодії синаптичних везикул між собою на етапі екзоцитозу – докінгу, який передує стимульованому злиттю мембран.
На моделях злиття гетеротипних і гомотипних мембран було показано, що препарат леветірацетам (2 мг/мл) зменшує рівень їх кальцій-ініційованого злиття. Рівень злиття синаптичних везикул з плазматичними мембранами синаптосом (гетеротипні мембрани) в контролі на 4-й хвилині становив 28% , а при додаванні в середовище інкубації 2 мг/мл леветірацатема рівень злиття мембран знизився до 23%. За той же період часу, рівень злиття синаптичних везикул між собою (гомотипне злиття) під дією леветірацетаму зменшувався на 5 % в порівнянні з контролем. При дослідженні впливу предінкубаціі синаптичних везикул з леветірацетамом (10 хв при 22 ° С) виявлено ще більше інгібування процесу ініційованого кальцієм злиття гетеротипних і гомотипних мембран. Рівень кальцій-залежного злиття мембран без леветірацетама в середовищі характеризується найбільшим значенням, тобто, можна припустити, що в цьому випадку, протеїн SV2А виступає в якості позитивного модулятора етапу екзоцитозу, що досліджувався.
Висновки. При використанні леветірацетаму в якості інструменту досліджень були отримані нові дані щодо ??участі протеїну SV2A в регуляції процесу екзоцитозу на етапах докінгу синаптичних везикул та їх кальцій-стимульованого злиття з мембранами мішенями.
УДК 577.112:616
С.В. ДАНІЛОВСЬКИЙ, Д.О. МІНЧЕНКО, І.В. КРИВДЮК, В.В. ЯВОРСЬКИЙ, О.Г. МІНЧЕНКО1
ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ Tp53 ТА ЗАЛЕЖНИХ ВІД НЬОГО ПРОТЕЇНІВ У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ ЛІНІЇ U87 З ПРИГНІЧЕНОЮ ФУНКЦІЄЮ ЕНЗИМУ ERN1
1Відділ молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
2Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика
Ензим ERN1 є найважливішим сенсорно-сигнальним ензимом стресу ендоплазматичного ретикулуму. Злоякісні пухлини використовують стрес ендоплазматичного ретикулуму, як і умови гіпоксії та ішемії, для активації процесів проліферації. Більше того, залежний від стресу ендоплазматичного ретикулуму сенсорно-сигнальний шлях ERN1 тісно пов'язаний з процесами апоптозу та смерті клітин, оскільки пригнічення функції гена ERN1 суттєво знижує швидкість росту пухлин. Метою цієї роботи було дослідження експресії генів TP53 (супресор пухлин 53), MDM2 (убіквітин протеїнлігаза р53), PIGPC або PERP (ефектор апоптозу, опосередкованого TP53) та USP7 (специфічна до убіквітину пептидаза 7; ензим деубіквітинації) у клітинах гліоми лінії U87 з пригніченою функцією ензиму ERN1.
Дослідження рівня експресії генів, що контролюють процеси проліферації та апоптозу (TP53, MDM2, PIGPC та USP7) проведені на клітинах гліоми лінії U87, а також двох сублініях цих клітин з повним або частковим пригніченням функції ензиму ERN1byqPCR. Повне пригнічення функції ензиму ERN1 досягалось шляхом виключення обох ензиматичних активностей (протеїнкінази та ендорибонуклеази), а часткове – виключенням лише ендорибонуклеазної активності цього біфункціонального ензиму. Умови дефіциту глютаміну чи глюкози моделювали шляхом заміни середовища вирощування клітин на таке, що не містило цих компонентів.
Встановлено, що повна блокада функції гена ERN1 у клітинах гліоми лінії U87 збільшує рівень експресії генів TP53 та UPS7, але істотно не впливає на рівень експресії гена PERP. В той же час, рівень експресії гена MDM2 при цьому істотно знижується. Таким чином, збільшений рівень експресії гена TP53 чітко корелює зі зниженим рівнем експресії ензиму, що ініціює його деградацію, убіквітин протеїнлігази р53 (MDM2) та посиленою експресією гена USP7, який відповідає за деубіквітинацію TP53 та MDM2 і таким чином індукує залежний від p53/TP53 апоптоз і пригнічення росту пухлини. Показано також, що виключення лише ендорибонуклеазної активності ERN1 рівень експресії всіх досліджених генів. Більше того, рівень експресії генів TP53, PERP та USP7 істотно не змінюється у контрольних клітинах гліоми лінії U87 за умов дефіциту глюкози чи глутаміну у середовищі, але повне виключення функції гена IRE-1 призводить до збільшення рівня експресії гена TP53 і зниження гена PERP. В той же час, рівень експресії гена MDM2 істотно збільшується в обох типах клітин за умов дефіциту глутаміну, а за умов дефіциту глюкози – лише у клітинах з виключеною функцією ензиму ERN1.
Таким чином, отримані результати свідчать про залежність експресії генів TP53 і більшості асоційованих з ним протеїнів від стресу ендоплазматичного ретикулуму і корелюють з пригніченням росту пухлин гліоми.
УДК 546.26.043
М.О. ДЕКАЛЮК
ФЛУОРЕСЦЕНТНІ ВУГЛЕЦЕВІ ТОЧКИ: СИНТЕЗ ТА СПЕКТРОСКОПІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Вуглецеві точки є новими перспективними наноматеріалами для науки і техніки. Вони є багатообіцяючими для створення біосенсорних датчиків та для візуалізації біологічних об`єктів. Найбільший інтерес до вуглецевих точок у порівнянні з іншими флуоресцентними наночастиноками (наприклад, квантовими точками) обумовлений їх легким і безпечним створенням («green synthesis»). Їм притамана висока яскравість, відсутність токсичності, широкий спектр можливостей для модифікації та функціоналізації.
Флуоресцентні вуглецеві точки були отримані за допомогою двох різних методик – за допомогою гідротермічної обробки крохмалю і сахарози при температурі 180оС на протязі 3 годин до отримання коричневої суспензії та подальшої очистки готового зразка («блакитні точки"), а також методом мікрохвильової (700 W на протязі 6 хвилин) обробки гліколю («зелені точки»). Ці матеріали характеризували спектрами поглинання світла, а також спектрами флуоресценції збудження і випромінювання. Ми показали, що при використанні різних методів синтезу, вуглецеві наноточки характерізуються різними спектроскопічними властивостями: максимальна смуга флуоресценції займає різні позиції в синьо-зеленому діапазоні видимого спектру, при одній хвилі збудження. Обидва отриманних зразка мають максимум збудження на 350 нм та максимум флуоресценції на 450 та 475 нм відповідно. Механізми поглинання світла і флуоресценції не є повністю зрозумілими. У цьому відношенні, ми провели спеціальні експерименти на збудження флуоресценції на розширеному діапазоні довжин хвиль поглинання. З отриманних даних було відмічено, що кореляції збудження-випромінювання і відзначений сильний Стоксів зсув означає, що у цих зразках спостерігаються деякі до цих пір невідомі явища релаксації в збуджених станах. Отримінні зразки мають розміри флуоресцентних часточок у диапазоні 10-50 нм, що свідчить про деяку негомогенність зразку. Вивчені точки вуглецю демонструють високу температурну (10-80оC) і рН (2-13) стабільність без зменшення інтенсивності свічення та зміни позиції на спектрі відимого світла.
За цими визначними флуорецентиними властивостями вуглецевих точок можно відмітити потенційну можливість використання їх як перспективні платформи для складання багатофункціональних нанокомпозитів для використання у діагностиці in vivo і доставки ліків. Також планується отримати гібридні структури, які можуть поєднати у собі флуоресцентні та магнітні властивості з перспективою подальшої функціоналізації.
УДК 616.34-006.04-085-06:[616.831.31+616.61+616.36]-091.8-092.9
Ю.В. СОРОКА, Н.Є. ЛІСНИЧУК, І.Я. ДЕМКІВ, О.В. ЧИХИРА
СТАН АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ ЗА УМОВ ЗМОДЕЛЬОВАНОЇ ХРОНІЧНОЇ НЕОПЛАСТИЧНОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ
Центральна науково-дослідна лабораторія, ДВНЗ «Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського МОЗ України», Тернопіль;
Вступ. Серед етіологічних факторів пухлин людини найбільш важлива роль належить агентам хімічної природи – канцерогенам і модифікаторам канцерогенезу. Канцерогени можуть діяти в зоні первинного контакту, в зоні локалізації або накопичення у органі-мішені, в місцях екскреції або метаболічних перетворень. До групи генотоксичних канцерогенних речовин належать: поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ), нітрозосполуки, мікотоксини, ароматичні аміни, у тому числі 1,2– диметилгідразину дигідрохлорид (ДМГ). Останній і вибраний нами для моделювання хронічної онкогенної інтоксикації. Одним з критеріїв вибору даної моделі також стало те, до ДМГ у процесі біотрансформації, що відбувається у печінці, утворює метаболіти, які, потрапляючи у кишечник, і викликають розвиток пухлин.
Тому метою нашого дослідження є з’ясувати особливості перебігу антиоксидантних процесів та процесів вільнорадикального окислення за умов змодельованої хронічної неопластичної інтоксикації.
Методи. Для дослідження використали 60 білих щурів масою 180-185 грам. Хронічну неопластичну інтоксикацію моделювали згідно методики В.П. Дерягіної (2009). У гомогенатах нирки та печінки досліджували концентрацію малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон’югатів (ДК) згідно методики М.В. Владимирова (1972); стан АОС оцінювали за змінами активності каталази (Кат) (Королюк, 1988), супероксиддисмутази (СОД) (Чеварі, 1985), глутатіонпероксидази (ГП) і глутатіонредуктази (ГР) за методикою Круглікова Г.О. (1976). Концентрацію відновленого глутатіону (G-SH) згідно методики Ellman G.L. (1959).
Результати. Встановлено суттєве підвищення концентрації МДА
у гомогенатах печінки і нирки – у 2,0 та 2,1 рази відповідно у порівнянні
з аналогічним показником у групі контрольних тварин. Концентрації ДК
у гомогенатах досліджуваних органів за даних патологічних умов також достовірно зростали. Активність СОД достовірно знижувалась відносно аналогічних показників у контрольній групі тварин: у тканині печінки на 31,6 % та у тканині нирки – на 31,8 % відповідно. Спостерігалось достовірне зниження активності Кат як у тканині печінки (на 28,1 %) та у тканині нирки (28,1 %) порівняно з тваринами контрольної групи. При диметилгідразиновій токсемії активність ГП у тканині печінки знижувалася у 1,8 рази, а у тканині нирки – у 1,4 рази. Хімічно індукований канцерогенез знижував активність ГР у 1,3 рази в тканині печінки, так і у тканині нирки. Концентрація ВГ у тканині печінки достовірно зменшилася у 1,6 рази, а у тканині нирки – у 1,9 рази у порівнянні з групою неуражених тварин.
Висновки. При хронічній неопластичній інтоксикації відбувається суттєва активізація процесів вільнорадикального окиснення, підвищене накопичення в крові токсичних продуктів пероксидного окиснення ліпідів, і, як наслідок, виражене ослаблення та дисбаланс ферментативних систем антиоксидантного захисту.
УДК 577.352.4
О.В. КОЛОМІЄЦЬ, Ю.В. ДАНИЛОВИЧ, Г.В. ДАНИЛОВИЧ
ДОСЛІДЖЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТРАНСПОРТУ ІОНІВ Са В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ ІЗ ВИКОРИСТАННЯМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЗОНДУ Fluo-4 AM
Інститут біохімії ім. О. В.Палладіна НАН України, Київ;
e-mail:
Загальновідома роль мітохондрій (МХ) в регуляції Са2+-гомеостазу у клітинах гладеньких м’язів. Також, функціонування Са2+-транспортувальних систем внутрішньої мембрани МХ здатне підтримувати оптимальну концентрацію іонів Са в їхньому матриксі, що забезпечує нормальну роботу електрон-транспортного ланцюга. Акумуляція Са2+ МХ гладенького м'язу пов’язана із Са2+-уніпортером, водночас зворотній процес вивільнення катіону забезпечується Са2+/Н+-обмінником. Дані щодо властивостей останнього в гладеньких м’язах вкрай обмежені.
Нами були досліджені процеси енергозалежного накопичення Са2+ та Са2+/Н+-обміну у МХ міометрія щурів із використанням Са2+-чутливого флуоресцентного зонду Fluo-4 АМ.
Показано, що енергезовані МХ міометрія здатні накопичувати та ефективно утримувати протягом відносно тривалого часу іони Са і швидко звільняти його за присутності іонофору А-23187 (10 мкМ). Акумуляція Са2+ МХ характеризується насиченням за субстратом переносу, уявна константа активації транспортного процесу (КСа) становить 53,9±6,9 (n=5) мкМ Са2+, що відповідає концентрації катіону у середовищі навколо МХ. В умовах дисипації градієнту протонів протонофором СССР (10 мкМ), блокування генерації ?рН олігоміцином (1 мкг/мл) та у присутності інгібітора мітохондріального Са2+-уніпортеру рутенієвого червоного (10 мкМ) акумуляція Са2+ суттєво зменшувалась.
Ефективність процесу вивільнення попередньо акумульованого Са2+ із МХ залежала від величини позамітохондріального рН. При його зниженні суттєво посилюється вихід іонів Са з МХ, що свідчить на користь існування ?рН-залежної компоненти транспорту Са2+ у їхній внутрішній мембрані і відповідає уявленням про функціонування Са2+/Н+-обмінника в МХ гладеньких м’язів. При залуженні середовища спостерігається додаткове зростання накопичення катіону, що доводить можливість функціонування обмінника в реверсному режимі. Градієнти фізіологічно значущих моновалентних катіонів Nа, К, а також Lі, не впливають на транспорт Са2+ з МХ.
Встановлено, що залежність ?рН-індукованого виходу Са2+ з МХ задовольняє кінетичним закономірностям реакції першого порядку. При закисленні позамітохондріального середовища від рН 7,5 до 5,0 час напіввивільнення катіону зменшується в 2,5 раза. Крива залежності швидкості транспортного процесу від концентрації протонів має тенденцію до насичення, а константа активації за протонами (-lgKн) cкладає 6,9±0,1 (n=7), що відповідає фізіологічним значенням рН цитозолю.
Отже, при вивченні властивостей акумуляції Са2+ та Са2+/Н+-обміну в МХ гладенького м’язу матки, нами, із використанням Са2+-чутливого флуоресцентного зонду Fluo-4 АМ, були кількісно охарактеризовані основні системи трансмембранного кальцієвого обміну в МХ міометрія.
Автори висловлюють подяку чл.-кор. Костеріну С. О. за обговорення одержаних результатів.
УДК 575.191:577.15:616.831-006-089:615.28
І.В. КРАВЧУК1, О.Я. ГЛАВАЦЬКИЙ1, О.В. МАРКОВА1, В.В. ЛИЛО2, Г.В. ХМЕЛЬНИЦЬКИЙ1
БІОЛОГІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛІТИН ГЛІОМ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЛЮДИНИ, ОТРИМАНИХ ЗА ДОПОМОГОЮ ЦЕНТРИФУГУВАННЯ
1ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад.А.П. Ромоданова» НАМН України, Київ, Україна;
2Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, Україна
Мета роботи – дослідити окремі характеристики клітин гліом головного мозку людини, отриманих за допомогою ступінчастого центрифугування.
Матеріали і методи. Під час оперативних втручань з приводу внутрішньомозкових пухлин супратенторіальної локалізації отримали фрагменти біоптатів пухлин у 14 пацієнтів (середній вік - 38,2 роки; співвідношення чоловіки : жінки = 10 : 4; 11 хворих оперувалися вперше, 4 паціента звернулися з приводу рецидиву пухлини). Тканину біоптата подрібнювали ножицями, піпетували, звільняли суспензії від великих фрагментів. Згідно рекомендацій J.E. De Vries et al.(1973) [1] суспензію звільняли від гинучих і загиблих клітин центрифугуванням у градієнті верографіна (d=1,078; 15 хвилин, 3000 об/хв.). Досліджували спонтанну загибель отриманих клітин [2], вплив різних доз мюстофорана (0,1 µМ-45,0 µМ) та вітчизняного препарату «Ербісол» за допомогою вітального барвника та МТТ-реактиву [3], показники суспензій через 48 годин після додавання у поживне середовище epidermal growth factor (EGF, “Sigma”, USA, кінцева концентрація 20-200 мкг/мл).
Результати. Встановлено, що первинні суспензії клітин гліом людини містять тільки 27,2% життєздатних клітин (розмах варіювання показника 7,0 – 57,8). Застосування методу J.E. De Vries et al.(1973) [1] дозволило у тричі (83,9%) збільшити питому вагу життєздатних клітин (розмах варіювання показника 62,5 – 100,0), зменшити спонтанну загибель клітин у подальших короткострокових тестах. При дослідженні впливу мюстофорану (24 години культивування) в тесті з вітальним барвником ми спостерігали ЦІ50 у 4 з 12 паціентів (доза мюстофорана 0,1 µМ-0,34 µМ), у 3 з 8 паціентів (доза мюстофорана 1,7 µМ-6,75 µМ) та у 7 з 11 паціентів (доза мюстофорана 15,0 µМ-45,0 µМ). При дослідженні впливу мюстофорану шляхом застосування МТТ-реактиву тенденція зберігалася, але повної відповідності результатів тесту з вітальним барвником не було. Наприклад, при застосуванні МТТ-реактиву для оцінки цитотоксичності мюстофорану ЦІ50 ми спостерігали у 3 з 9 паціентів (доза мюстофорана 15,0 µМ-45,0 µМ) і тільки у 1 з 9 паціентів (доза мюстофорана 0,1 µМ-0,34 µМ). 48-годинне культивування у поживному середовищі, що містить EGF, супроводжувалася 2-3 кратним збільшенням ядровмісних клітин.
Висновки. Отримані дані свідчать про можливість і доцільність використання клітин гліом головного мозку людини, отриманих за допомогою ступінчастого центрифугування, для дослідження їх біологічних характеристик при призначенні комбінованого лікування.
Література.
1.De Vries J.E., Van Benthem M., Rumke P. Separation of viable from nonviable tumor cells by flotation on a Ficoll-Triosil mixture // Transplantation.-1973.-41.-p.208-214.
2. Маркова О.В. Состояние естественной киллерной активности лимфоцитов периферической крови больных с опухолями головного мозга // Автореферат дис. к. мед.н.- Киев.- 1990.- 23с.
3. Главацький О.Я., Маркова О.В., Лило В.В., Ахмад Хассан. Спосіб визначення in vitro чутливості клітин злоякісних гліом головного мозку до цитотоксичної дії хіміопрепарату // Патент UA 69879 U. Опубл. 10.05.2012.-Бюл.№9.
УДК 577.352.4+544.147+544.176+544.168
Ю.Ю. МАЗУР, Т.О. ВЕКЛІЧ, О.А. ШКРАБАК, О.В. БЕВЗА
ІНГІБІТОР Са2+,Mg2+-АТФази ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КАЛІКС[4]АРЕН C-90 ЯК МОДУЛЯТОР КОНЦЕНТРАЦІЇ Са2+ У МІОЦИТАХ МАТКИ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Незважаючи на важливу роль Са2+,Mg2+-АТФази плазматичної мембрани (ПМ) у підтриманні сталої концентрації Са2+ у цитозолі, на сьогодні не існує специфічного інгібітора зазначеного ензиму. В останні роки у відділі біохімії м’язів ІБХ НАНУ було продемонстровано, що таким інгібітором може стати калікс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(фенілсульфониліміно)метиламіно-25,26,27,28-тетрапропоксікалікс[4]арен).
Метою роботи стало дослідження впливу калікс[4]арену С-90 на ензиматичну активність Са2+,Mg2+-АТФази ПМ та моделювання ефекту цієї сполуки на цитоплазматичну концентрацію Са2+.
У роботі були використані методи препаративної біохімії, ензимології, докінгу, математичного моделювання.
Було встановлено, що при дії С-90 уявна максимальна початкова швидкість реакції гідролізу АТФ знижувалася, І0,5 становила 20,2±0,5 мкМ (M±m, n=5). Внесення калікс[4]арену в середовище інкубації у концентраціях 0,1-10 мкМ на фоні різних концентрацій Са2+ призводило до зміни уявної константи активації щодо Са2+ від 190±0,5 нМ до 312±23 нМ та коефіцієнта Хілла від 2,1±0,1 до 1,5±0,1. Зменшення спорідненості та зниження позитивного кооперативного ефекту спостерігалося при відносно великих концентраціях калікс[4]арену (50-100 мкМ). За допомогою докінгу було визначено найбільш вірогідні місця зв’язування С-90 з Са2+,Mg2+-АТФазою: ділянка, структурно близька до зони зв’язування Са2+ (петля між спіралями М4-М6 і спіраль М8). Було встановлено, що в утворенні комплексу ензиму з калікс[4]ареном найбільш важливими є гідрофобні, стекінг- та електростатичні взаємодії.
З врахуванням визначених кінетичних параметрів чутливості Са2+,Mg2+-АТФази ПМ до інгібуючої дії С-90 було розроблено кількісну модель (у стаціонарному режимі) індукції цим калікс[4]ареном збільшення базальної концентрації Са2+ у міоцитах, на основі якої було отримано залежність базальної концентрації Са2+ від константи проникності мембрани, позаклітинної концентрації Са2+, константи активації для Са2+, максимальної швидкості роботи помпи. За концентрації калікс[4]арену С-90 10-6-2?10-5 М хід кривої зміни внутрішньоклітинної концентрації є пологим, а за концентрації інгібітору, вищої за 2?10-5 М, крива наближається до експоненціальної залежності. Таким чином, одержані дані дають підставу сподіватися, що використання С-90 у низьких концентраціях (<10-20 мкМ) буде мати помірний вплив на цитозольну концентрацію Са2+ (зростає не більше, ніж у 2 рази, відносно початкової величини).
Автори вдячні член-кор. НАНУ С. О. Костеріну за обгоренні одержаних експериментальних результатів.
УДК 577.25
К.Ю. МАНОЙЛОВ, Н.В. КОРОТКЕВИЧ, А.Ю. ЛАБИНЦЕВ
ВЗАЄМОДІЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПОХІДНОГО ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСИНУ З РЕЗИСТЕНТНИМИ ДО ЙОГО ДІЇ КЛІТИНАМИ МИШІ (Mus musculus L) ЛІНІЇ L929
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Дифтерійний токсин (ДТ) порівняно із іншими бактеріальними екзотоксинами має одне із найменших значень напівлетальної дози для чутливих до нього організмів, проте деякі види ссавців є нечутливими до його дії. Раніше у нашій лабораторії було створено рекомбінантний нетоксичний флуоресцентний аналог ДТ, протеїн EGFP-SbB, у якому субодиницю А токсину, яка відповідає за цитотоксичну дію токсину, було замінено на послідовність зеленого флуоресцентного протеїну EGFP. Клітини лінії L929, отримані із організму миші хатньої (Mus musculus L), є однією із класичних моделей резистентних до ДТ клітин, в той час як клітини лінії Vero, отримані із організму зеленої мавпи (Cercopithecus aethiops L), є класичною моделлю високо чутливих до ДТ клітин. Оскільки дані лінії клітин є відомими моделями дослідження токсичної дії ДТ, порівняння характеру взаємодії токсину з клітинами цих ліній може надати важливу інформацію для розуміння механізмів резистентності клітин до ДТ. Тому, метою даної роботи було встановлення особливостей зв’язування з поверхнею клітин та інтерналізації всередину клітин протеїну EGFP-SbB на прикладі клітинної лінії L929 у порівнянні з клітинною лінією Vero.
Протеїн EGFP-SbB специфічно зв’язувався як з поверхнею резистентних клітин L929 так і чутливих до ДТ клітин Vero, що було показано з використанням методу протокової цитометрії. Розрахована за цими результатами константа зв’язування для резистентних клітин L929 була близькою до константи зв’язування з чутливими до ДТ клітинами Vero. Також було продемонстровано з застосуванням методу конфокальної мікроскопії, що отриманий протеїн інтерналізувався цими клітинами у складі ендосом. Рекомбінантний протеїн CRM197, який являє собою повнорозмірний нетоксичний точковий мутант ДТ, конкурентно витісняв протеїн EGFP-SbB із комплексу з рецептором на поверхні клітин. Розрахована за результатами протокової цитометрії константа інгібування протеїном CRM197 зв’язування протеїну EGFP-SbB з клітинними рецепторами мала близьке значення для обох клітинних ліній. Проте, клітини L929 зв’язували приблизно в 4 рази меншу та поглинали приблизно в 2 рази меншу кількість молекул протеїну EGFP-SbB порівняно з клітинами Vero.
Одержані результати свідчать про те, що молекули ДТ здатні зв’язуватися та проникати в цитоплазму резистентних клітин, а механізми резистентності клітин ссавців до дії ДТ реалізуються після етапу проникнення токсину в клітини, а саме – під час процесів внутрішньоклітинного трафіку токсину в ендосомах клітин.
УДК 577.115.3:[616.39-056.257]-092.9.
О.В. ОНОПЧЕНКО
ВПЛИВ N-СТЕАРОЇЛЕТАНОЛАМІНУ НА ФОСФОЛІПІДНИЙ СКЛАД ПЕЧІНКИ ЩУРІВ З ІНДУКОВАНИМ ІНСУЛІНОРЕЗИСТЕНТНИМ СТАНОМ
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, м. Київ;
Існує багато експериментальних даних, які свідчать про вплив N-ацилетаноламінів на регуляцію метаболізму ліпідів. Так, була показана здатність насиченого N-стеароїлетаноламіну проявляти мембраностабілізуючі та мембранопротекторні властивості за різних патологічних станів. Відомо, що високожирова дієта викликає зміни у ліпідному складі плазматичних мембран, що спричиняє порушення рецепції інсуліну в інсулінзалежних тканинах. Тому метою роботи було вивчити вплив N-стеароїлетаноламіну на фосфоліпідний склад печінки щурів з експериментальним інсулінорезистентним станом.
Інсулінорезистентний стан викликали навантаженням жировою дієтою (58% жирів) протягом 6 місяців у комбінації з одноразовою ін’єкцією розчину стрептозотоцину (15 мг/кг). Тварин з порушеною толерантністю до глюкози було відібрано та розділено на 2 групи: «ІР стан» (n=10), «ІР+NSE» (n=10), які отримували водну суспензію NSE (50 мг/кг) 2 тижні. Паралельно було виділено 2 групи контрольних тварин, які отримували стандартний раціон віварію (4% жирів): група «Інтактні» (n=6) та «NSE» (n=6), які отримували водну суспензію NSE (50 мг/кг) 2 тижні. В печінці щурів досліджували вміст фосфоліпідів.
Показано, що розвиток ІР стану у щурів зумовлює суттєві зміни у складі основних фосфоліпідів печінки. Виявлено вірогідне зростання рівня фосфатидилхоліну (ФХ) (9,15±0,45) та фосфатидилетаноламіну (ФЕ) (4,06±0,21), у порівнянні з інтактними тваринами (7,83±0,28 та 2,67±0,47 відповідно). Їх вміст корелює з рівнем інсуліну (r=0,57; r=0,62) та значенням індексу HOMA (r=0,51; r=0,61). У групі «ІР стану» спостерігалося значне зниження вмісту фосфатидилінозитолу (ФІ) (0,41±0,05), фосфотидилсеріну (ФС) (0,26±0,03) та сфінгомієліну (СМ) (0,49±0,05) відносно значень у інтактних щурів (0,75±0,14; 0,62±0,15; 1,22±0,16), що зворотно корелює з рівнем індексу інсулінорезистентності (r= -0,62; r= -0,47; r= -0,68). Введення NSE за ІР стану, сприяло зниженню рівня ФХ (7,49±0,43) і ФЕ (3,45±0,16), та одночасному зростанню вмісту аніонних фосфоліпідів ФІ (0,71±0,1) і ФС (0,46±0,08). Також за дії NSE відбувалося вірогідне підвищення вмісту СМ (0,7±0,08) у печінці щурів з ІР станом.
Таким чином, введення NSE за інсулінорезистентного стану нормалізує вміст основних фосфоліпідів у печінці щурів з жировим навантаженням, що корелює зі зниженням рівня інсуліну та підвищенням чутливості до нього. Оскільки метаболізм досліджуваних фосфоліпідів тісно пов’язаний з проведенням трансмембранних сигналів у клітинах, то, ймовірно, нормалізація їх вмісту за дії NSE сприятиме відновленню інсулінового сигналінгу.
УДК 577.15:616-006.699
А.А. ПАВЛЕНКО, М.В. ГОРІЛА, І.В. ЛЕУС, Н.І. ШТЕМЕНКО
ПОКАЗНИКИ КРОВІ ПРИ РОЗВИТКУ РЕЗИСТЕНТНОЇ ДО ЦИСПЛАТИНУ КАРЦИНОМИ ГЕРЕНА ТА ХІМІОТЕРАПІЇ
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара, Дніпропетровськ
Значущими ознаками онкологічних захворювань, що вказують на злоякісність пухлинного росту, є порушення гемо- та еритропоезу, зменшення (гіпопротеїнемія) загального білка (ЗБ) плазми та окремих білкових фракцій (БФ). Ці зміни не є специфічними, але відображають загальну характеристику патологічного процесу (запалення, некроз новоутворення), динаміку та ступінь тяжкості захворювання. Резистентність пухлин до лікарських препаратів є однією з актуальних проблем сучасної онкології. Тому, метою роботи було дослідити морфологічні і біохімічні показники крові при розвитку резистентної до цисплатину карциноми Герена (Т8*) та проведенні хіміотерапевтичних заходів, оскільки подібні дослідження раніше не проводилися.
Визначали вміст ЗБ за біуретовою реакцією, співвідношення БФ, морфологічні характеристики еритроцитів цитохімічним методом, кількість еритроцитів та гематокрит. Застосовували методи математичної статистики.
Розвиток резистентної до цисплатину Т8* призводить до зниження на 47% концентрації ЗБ, на тлі цього знижується рівень альбумінів на 28%, ?-глобулінів на 69% та ?-глобулінів на 18%, а вміст ?2-глобулінової фракції підвищується на 34%. Також, порівняно з контролем, відмічалося зниження гематокриту на 15%, кількості еритроцитів на 24%, при цьому рівень дискоцитів знижувався у 2 рази, а ехіноцитів та патологічних форм збільшувався у 2 та 10 разів відповідно. Введення розчину цисплатину сприяло підвищенню ЗБ на 39% порівняно з групою Т8*, при цьому зростав вміст ?-глобулінової та ?-глобулінової фракцій на 50% та 75% відповідно. Інші показники достовірно не змінювалися. При введенні щурам-пухлиноносіям системи Реній-Платина ([Re]nl+cPt) виявлено збільшення ЗБ на 44%, вміст ?2-глобулінів знижувався на 24%, кількість дискоцитів була вища на 16%, а рівень патологічних форм еритроцитів зменшувався на 74% порівняно з Т8*, кількість еритроцитів та гематокрит – на рівні контрольних значень.
Отже, розвиток резистентності до цисплатину призводив до зміни морфологічної картини еритроцитів у бік незворотних деформаційних процесів, гіпопротеїнемії та зміни співвідношення БФ у щурів з Т8*. Введення цисплатина виявило зміни тільки у білковому обміні плазми крові, тоді як введення системи Реній-Платина сприяло загальному поліпшенню якісного та кількісного складу крові. Отже, позитивний вплив на показники крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена робить систему Реній-Платина перспективним протипухлинним препаратом.
УДК 577.218+616-006
Г. ПАСІЧНИК 1, 2, О. ПОВОРОЗНЮК 1,2, Н. БИЦЬ 1, О. ПОНОМАРЕНКО 1, Д. ГЕРАЩЕНКО1,2, А. БАЗАЛІЙ1, Д. ПЕТУХОВ1, А. САМОЙЛЕНКО1, Л. ДРОБОТ 1
НАДЕКСПРЕСІЯ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ RUKl/CIN85 У АДЕНОКАРЦИНОМНИХ КЛІТИНАХ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ ЛІНІЇ MCF-7 СУПРОВОДЖУЄТЬСЯ ПІДВИЩЕННЯМ ЇХ ХІМІОРЕЗИСТЕНТНОСТІ
1Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ;
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;
e-mail:
Резистентність до численних хіміотерапевтичних препаратів – розповсюджена проблема у лікуванні онкологічних захворювань. Розвиток множинної стійкості до лікарських препаратів пов’язаний з блокуванням апоптозу, активацією систем детоксикації та змінами в регуляції клітинного циклу. Результати наших попередніх досліджень продемонстрували підвищення експресії адаптерного протеїну Rukl/CIN85 в аденокарциномах молочної залози людини, особливо в зонах інвазивного росту. Встановлено, що субклони слабко інвазивних аденокарциномних клітин молочної залози людини лінії MCF-7 зі стабільною надекспресією адаптерного протеїну Rukl/CIN85 набувають фібробластоподібної морфології, характеризуються зниженням інтенсивності росту та адгезивності, підвищеними виживанням, колонієутворювальною здатністю та рухливістю. Метою даної роботи було проаналізувати чутливість клітин MCF-7 з надекспресією Rukl/CIN85 до низки протипухлинних препаратів, а також дослідити стан активності ланок регуляторних систем, потенційно залучених до розвитку хіміорезистентності.
Вплив доксорубіцину, цисплатину, етопозиду та тамоксифену на виживаність досліджуваних клітин аналізували за допомогою МТТ тесту. Розподіл клітин за фазами клітинного циклу, вміст та активність мембранних транспортерів, зокрема, ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein), досліджували протоковою цитофлуориметрією. Активність альдегіддегідрогенази (ALDH) оцінювали флуориметрією з використанням PicoProbe™ ALDH Assay Kit.
За даними метаболічної активності клітини з надекспресією Rukl/CIN85, оброблені доксорубіцином, цисплатином, етопозидом та тамоксифеном, виявились стійкіші до дії протипухлинних препаратів порівняно з контрольними клітинами. Для з’ясування можливих механізмів, залучених до підвищення хіміорезистентності клітин, що надекспресують Rukl/CIN85, оцінювали вміст та активність АТР-зв’язувальних касетних мембранних транспортерів. Достовірно більший відсоток ABCG2-позитивних клітин, клітин у G0/G1 фазі клітинного циклу, а також вищий рівень активності ALDH було виявлено у сублінії MCF-7 з найвищим рівнем надекспресії Rukl/CIN85. Активність мембранних касетних транспортерів оцінювали за викидом флуоресцентного барвника родаміну123. Встановлено, що ефективність виключення даного барвника позитивно корелює з рівнем експресії Rukl/CIN85 у клітинах MCF-7. Слід зазначити, що пригнічення експресії Rukl/CIN85 за допомогою sіRNA-інтерференції частково знімало виявлені ефекти.
Отримані дані свідчать про потенційну роль адаптерного протеїну Rukl/CIN85 у розвитку хіміорезистентності клітин аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF-7.
УДК 576.08
К.О. ПИРШЕВ
НОВІ МЕТОДИ ДЕТЕКЦІЇ ЗАПРОГРАМОВАНОЇ ЗАГИБЕЛІ ЧЕРВОНИХ КЛІТИН
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Унікальною особливістю еритроцитів є те, що їх плазматична мембрана – це єдиний компонент, залучений до антигенних, транспортних та механічних характеристик. Як і ядерні клітини, еритроцити спроможні викликати свою загибель з послідуючою елімінацією макрофагами. Цей процес є особливо важливим завдяки тому, що він дозволяє безпечно для організму виводити токсичні гемові групи. Для суїцидальної загибелі еритроцитів, або ериптозу, характерно зморщування клітини еритроциту, зміна структури мембрани та вихід на її поверхню фосфотиділсерину, тобто усі властивості типові для апоптозу ядерних клітин. Незважаючи на схожі етапи протікання цих процесів, регуляторні механізми, що впливають на ериптоз, та дія зовнішніх факторів можуть бути іншими. З ериптозом пов’язані такі захворювання як анемії, гемолітичний уремічний синдром, хворобу Вілсона, недостатність фосфату, мутації GLUT1, діабет 2 типу, ефекти внаслідок дії лікарських препаратів та багато іншого (Foller, Huber et al. 2008; Lang, Gulbins et al. 2008).
Саме тому так важливо мати простий, але чутливий метод для детекції цього процесу. Відомий поширений підхід із використанням флуоресцентно-міченого Annexin V має ряд недоліків, серед яких складний протокол підготування зразків, необхідність специфічних розчинів для інкубації, залежність від концентрації та вузькі можливості застосування (Demchenko 2012). Підхід із використанням флуоресцентного зонду NR12S, що базується на барвнику Нільський червоний, спроможний подолати ці недоліки. Синтезований у 2010 році колективом наших колег із Університету Страсбурга (Kucherak, Oncul et al. 2010) він був вперше застосований для детекції ериптозу колективом лабораторії нанобіотехнологій інституту біохімії О.В. Палладіна НАНУ.
Для виконання цієї роботи була відпрацьована модель ериптозу на еритроцитах крові здорових донорів із застосуванням таких індукторів як сфінгозин, валіноміцин, куркумін та інші. Індукція еритроцитів до ериптозу в ході всієї роботи перевірялася за допомогою стандартних підходів із використанням флуоресцентно-міченого Annexin V та детекції розміру клітин, використовуючи канал розсіювання світла на проточному цитофлуориметрі (Sopjani, Foller et al. 2009; Qadri, Bauer et al. 2011). Були розроблені протоколи підготовки зразків та вимірювання при використанні NR12S для детекції ериптозу у таких методах як проточна цитофлуориметрія, спектрофлуориметрія, спектрофотометрія та флуоресцентна мікроскопія.
Одержані порівняльні результати свідчать, що методи з використанням NR12S для детекції та вивчення ериптозу є більш перспективним та інформативним у порівнянні із існуючими підходами.
УДК 615.015.13: 615.217: 615.015.23
О.В. ПУПИШЕВА
ПЕРСПЕКТИВИ СТВОРЕННЯ СПАЗМОЛІТИКІВ СЕЧОВОГО МІХУРА
державна установа «Інститут фармакології та токсикології НАМН України», Київ;
Вступ. Створення нового лікарського засобу тривалий та економічно витратний процес, який на сучасному рівні досягнень різних галузей науки можна більш ефективно реалізовувати шляхом комп’ютерного аналізу хімічних, біохімічних та біологічних особливостей речовин, зокрема, за допомогою програми РАSS (Prediction of Activity Spectra for Substances), алгоритм якої базується на аналізі хімічної будови нової сполуки та порівнянні її з іншими вже дослідженими сполуками, існуючими лікарськими засобами, та їх біологічною активністю. На сьогоднішній день актуальним є пошук сполук, які б селективно модулювали порушення функціонування сечового міхура, що виникають за умов його гіперактивності та призводять до збільшення частоти сечовипускань вдень і вночі, епізодів нетримання сечі, що значно погіршує якість життя хворого.
Методи. З метою створення нового спазмолітика сечового міхура нами був проведений комп’ютерний прогноз біологічної активності віртуальної бази похідних 5Н-циклопента[d]піримідину, серед яких визначені перспективні сполуки, які в подальшому були синтезовані. Проведені дослідження спазмолітичної активності синтезованих сполук in vitro на смужках сечового міхура у інтактних щурів та in vivo за умов експериментальної патології сечового міхура.
Результати. В результаті віртуального скринінгу було відібрано 10 сполук, що за даними програми РАSS здатні проявляти спазмолітичні властивості, зокрема шляхом модуляції рівня цАМФ, інгібуванням цГМФ- та цАМФ-залежних фосфодіестераз.
В дослідженнях на попередньо скорочених гіперкалієвим (60 ммоль/л) розчином Кребса ізольованих смужках сечового міхура щурів виявлено, що 9 із досліджуваних похідних 5Н-циклопента[d]піримідину здатні сприяти зниженню тонусу, викликаного констриктором, більш як на 50 %. Найбільш активними виявились сполуки ІФТ 33 та ІФТ 35, які сприяли розслабленню ізольованих смужок детрузора на 83 та 94 %, відповідно.
В дослідженнях на наркотизованих самках щурів за умов циклофосфан-індукованої гіперактивності сечового міхура пероральне введення сполуки ІФТ 35 в дозі 20, 25 та 30 мг/кг викликало збільшення інтервалу між сечовипусканнями до 44,1±4,48, 48,71±3,2 та 49,02±4,2 сек, відповідно, порівняно із контрольним показником 36,6±1,42 сек.
Висновки. Отримані дані, щодо спазмолітичної активності сполук досліджуваного хімічного ряду, свідчать, що використання комп’ютерного моделювання є результативними методом для цілеспрямованого створення нових лікарських засобів, зокрема, для фармакотерапії гіперактивного сечового міхура.
УДК 577.151.042.5: 612.115
Я.М. РОКА-МОЙЯ, Д.Д. ЖЕРНОСЄКОВ, Т.В. ГРИНЕНКО
ПРО МЕХАНІЗМ ІНГІБУВАЛЬНОГО ЕФЕКТУ Lys-ПЛАЗМІНОГЕНУ НА АГРЕГАЦІЮ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ
Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, Київ;
Мембрана тромбоцитів виступає місцем локалізації білків системи активації плазміногену. Glu-плазміноген на поверхні тромбоцитів шляхом обмеженого протеолізу може перетворюватися на Lys-форму, що має відкриту конформацію і з більш високою швидкістю активується до плазміну. Нами показано, що екзогенний Lys-плазміноген, на відміну від нативної Glu-форми, пригнічує агрегацію тромбоцитів людини, стимульовану АДФ, тромбіном та колагеном [Рока-Мойя, 2012]. Тому метою роботи було встановлення ролі окремих структурних компонентів молекули плазміногену у забезпеченні виявленого ефекту.
Одним з можливих механізмів, що лежить в основі взаємодії плазміногену з його рецепторами є розпізнавання лізинзв’язувальними сайтами (ЛЗС) проензиму С-кінцевих залишків лізину поверхневих білків. 6-Аміногексанова кислота (6-АГК) є аналогом лізину і здатна блокувати таке зв'язування. В наших експериментах додавання 6-АГК (0,05-1 мМ) знімало інгібувальний ефект Lys-плазміногену на агрегацію. Беручи до уваги діапазон діючих концентрацій 6-АГК, можна зробити висновок про те, що до взаємодії Ліз-плазміногену з білками тромбоцитарної мембрани залучені ЛЗС високої та низької афінності, що знаходяться у кринглових доменах його молекули.
Надалі вивчали дію очищених препаратів крингл-вмісних фрагментів плазміногену, отриманих шляхом еластазного гідролізу. Встановили, що, на відміну від цілісної молекули, крингл 1-3, крингл 4 та їх комбінація у концентраціях 1,2 мкМ та 6 мкМ не впливають на тромбін-індуковану агрегацію відмитих тромбоцитів. Препарат міні-плазміногену, в якому каталітичну активність було заінгібовано апротиніном або п-нітро-гуанідинбензоатом, не пригнічує агрегацію. Проте, при внесенні еквімолярних концентрацій очищених препаратів 1-3 або 4 кринглів до реакційного середовища, що містить Lys-плазміноген, спостерігали відновлення швидкості та ступеню агрегації до контрольних значень. Отже, ЛЗС цих кринглових доменів є критичними в реалізації ефекту плазміногену.
Разом з тим, додавання інгібітору серинових протеїназ апротиніну (5,5 МЕ/мл) до агрегаційної суміші не впливає на інгібуючий ефект Lys-плазміногену на тромбін-індуковану агрегацію тромбоцитів. Варто зазначити, що така концентрація апротиніну не пригнічувала тромбоцитарну агрегацію.
На основі отриманих даних можна стверджувати, що для прояву антиагрегаційних властивостей необхідна цілісна молекула Lys-плазміногену. Зв’язування з поверхнею тромбоцитів та подальше пригнічення Lys-плазміногеном агоніст-індукованої агрегації відбувається за участю ЛЗС 1-3 та 4 кринглових доменів. Інгібування активності каталітичного домену плазміногену не супроводжується втратою його антиагрегаційних властивостей, що, можливо, пов’язано із залученням альтернативних сигнальних шляхів, що не потребують прояву протеазної активності ферменту.
УДК 663.253+577.346:612.015.11+577.152.141:616.61
М.В. САБАДАШКА, У.В. СТАРАНКО, Л.О. ДАЦЮК, В.Р. ДРЕЛЬ, Н.О. СИБІРНА
ПРИРОДНИЙ ПОЛІФЕНОЛЬНИЙ КОМПЛЕКС ВИНОГРАДУ КОРИГУЄ ПОКАЗНИКИ РАДІОІНДУКОВАНОГО ОКСИДАТИВНО-НІТРАТИВНОГО СТРЕСУ У ТКАНИНІ НИРКИ ЩУРІВ
Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна е-mail:
У відповідь на опромінення, в тому числі у низьких дозах, у клітинах утворюються у високих кількостях активні форми кисню (АФК) та оксиду азоту (АФН), а також індукуються процеси радіолізу води. Ці події призводять до розвитку оксидативно-нітративного стресу. Надзвичайно висока швидкість метаболічних процесів у тканині нирок визначає характер патологічних змін за дії радіації. Великий науковий інтерес та актуальність мають способи корекції радіоіндукованих змін поліфенольним комплексом винограду. Поліфеноли скавенджерують вільні радикали АФК та АФН, зокрема, вони можуть безпосередньо реагувати з ними, перетворюючи у продукти зі значно нижчою реактивністю.
Метою даної роботи було дослідити ефект препарату природного поліфенольного комплексу винограду (ППКВ) на розвиток оксидативно-нітративного стресу у корковому шарі нирки щурів за умов рентгенівського опромінення дозою 30 сГр.
Показники активності ензимів системи антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази (СОД), каталази (КТ), глутатіонпероксидази (ГПО), глутатіонредуктази (ГР)) та вмісту ТБК-позитивних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ТБК-ПП), сумарної активності NO-синтази (NOS) та вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту і нітротирозин-модифікованих протеїнів (NT протеїни) визначали на 24, 48 та 72 годину після дії радіації.
За впливу рентгенівського опромінення встановлено зростання вдвічі вмісту ТБК-ПП та NT протеїнів у клітинах коркового шару нирки на фоні зниження активності СОД та NOS на 72 годину експерименту, хоча активність СОД, КТ та ГПО на 24 та 48 години після радіаційного впливу перевищувала рівень контролю.
Споживання препарату ППКВ за 10 діб до та впродовж 3 діб після радіаційного впливу сприяло збереженню активності антиоксидантних ензимів в межах норми, а вміст ТБК-ПП був в 1,4 рази нижчим порівняно з даними за опромінення. Ефект препарату проявлявся і у здатності NOS продукувати достатню кількість оксиду азоту, про що свідчить збереження вмісту стабільних метаболітів NO на рівні контролю. За сумарного впливу препарату ППКВ та рентгенівського опромінення виявлено зниження вмісту NT протеїнів – головних маркерів нітративного стресу.
Таким чином, отримані результати свідчать про те, що препарат ППКВ коригує оксидативно-нітративний стрес, викликаний дією низької дози іонізуючого випромінювання. Поліфеноли виноградного вина реалізують стрес-протекторні функції через модуляцію активності ензимів системи антиоксидантного захисту та системи L-аргінін/NO.
УДК 616-006.004:615.371:616-097:616-037
Т.В. СИМЧИЧ, Н.І. ФЕДОСОВА, О.М. КАРАМАН, Г.П. ПОТЕБНЯ
ПОШУК ФАКТОРІВ ДЛЯ ПРОГНОЗУВАННЯ ДОЦІЛЬНОСТІ ТА МОНІТОРИНГУ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ КСЕНОГЕННОЇ ПРОТИПУХЛИННОЇ ВАКЦИНИ
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (ІЕПОР), Київ;
Вступ. Розробка більш ефективних засобів терапії раку була і залишається актуальною проблемою. В ІЕПОР проводяться роботи з конструювання ксеногенних протипухлинних вакцин на основі ембріональних протеїнів курки (ЕПК). На даний час було показано, що застосування ЕПК на різних модельних пухлинах відрізняється за ефективністю. Тому метою роботи стало дослідити наявність маркерів для прогнозу доцільності та моніторингу ефективності застосування вакцини на основі ЕПК у мишей з «чутливою» та «нечутливою» до її дії модельними пухлинами.
Методи: У вакцинованих та невакцинованих ЕПК мишей з саркомою 37 (С37) або карциномою легені Льюїс (КЛЛ), відповідно «нечутлива» та «чутлива» до дії ЕПК пухлини, отримували сироватки крові. Методом ІФА визначали наявність антитіл (АТ) проти «власних» антигенів пухлини (ПА) та ЕПК і розраховували кореляційний зв’язок між об’ємом пухлинного вузла та рівнем АТ проти ЕПК та ПА. Оскільки до складу ЕПК входять, зокрема металопротеїнази, то в роботі методом зимографії вивчали наявність у пухлинних екстрактах желатиназ як можливого фактору прогнозування доцільності введення вакцини.
Результати: Було показано, що «чутлива» і «нечутлива» пухлини продукують желатинази. Антитіла проти «власних» ПА та проти ЕПК виявили у практично однакової кількості не вакцинованих тварин не залежно від модельної пухлини. Проте, залежно від пухлини відрізнялась динаміка зміни рівня АТ проти ЕПК: протягом росту пухлини у мишей з С37 рівень АТ знижувався, а у мишей з КЛЛ – зростав. Відповідно, у мишей з С37 виявили виражений негативний (r=-0,48, р<0,07), а у мишей з КЛЛ – виражений позитивний (r=0,42; р<0,07) кореляційний зв’язок між рівнем АТ проти ЕПК та об’ємом пухлини.
У імунізованих мишей з С37 («нечутлива» до дії ЕПК) рівень АТ проти ЕПК не корелює із величиною пухлинного вузла, тоді як у мишей з КЛЛ («чутлива» модель) – має сильно виражену негативну кореляцію (r=-0,94, р<0,05) з об’ємом пухлини.
Висновки: продукція пухлиною желатиназ та сама по собі наявність АТ проти ЕПК не можуть бути використані як фактори прогнозу доцільності застосування вакцини на основі ЕПК. Проте, низькі рівні АТ проти ЕПК при великому пухлинному навантаженні вказують на недоцільність застосування вакцини. А зміна рівня АТ проти ЕПК і ПА протягом застосування вакцини може слугувати фактором моніторингу ефективності вакцинотерапії.
УДК 616-002.5
А.А. СІРОМОЛОТ, Т.А. РЕДЧУК
ВИЗНАЧЕННЯ ПОПУЛЯЦІЇ КЛІТИН-МІШЕНЕЙ БІЛКА Mycobacterium tuberculosis MPT63
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ;
ВСТУП: Туберкульоз — небезпечне інфекційне захворювання, що є причиною смерті близько 2 млн. людей щорічно. Низька ефективність сучасних методів контролю епідемічної ситуації на туберкульоз пов’язана, в тому числі, з недостатнім розумінням молекулярних механізмів патогенезу мікобактеріальної інфекції. Антиген Mycobacterium tuberculosis MPT63 є білком з невизначеною функцією. З літературних джерел випливає, що цей білок може бути задіяний у процеси інфікування та взаємодії з імунними клітинами. Метою нашої роботи було дослідити здатність одержаного флуоресцентного похідного MPT63 зв’язуватися з поверхнею клітин різного походження для пошуку популяції клітин-мішеней.
МЕТОДИ: При виконанні даної роботи були застосовані методи клонування ДНК, ПЛР, одержання рекомбінантних протеїнів в прокаріотичній системі експресії E.coli, металоафінної хроматографії, електрофорезу в поліакриламідному та агарозному гелі, вестерн-блоту, протокової цитофлуориметрії. Дані специфічного зв’язування антигену М.tuberculosis MPT63, злитого з червоним флуоресцентним білком mCherry, з клітинами різних типів обробляли спеціалізованою програмою для обробки даних з протокового цитофлуориметра FSC Express v3.0.
РЕЗУЛЬТАТИ: Було одержано клон-продуцент флуоресцентного похідного MPT63 шляхом клонування послідовностей генів флуоресцентного протеїну mCherry та мікобактеріального білка MPT63 (mCherry-MPT63) у вектор pET-28a. Цільовий протеїн був виділений та очищений методом металоафінної хроматографії. Аналіз продукції одержаного рекомбінантного флуоресцентного похідного мікобактеріального білка MPT63 показав, що близько 16% цільового білка синтезується в клітинах у розчинній формі, а 84% — у формі тілець включень. Вихід mCherry-MPT63 становив 36 мг на 1 л культури E.coli.
Макрофаги є найбільш описаною та охарактеризованою патогенетичною мішенню мікобактерій. Логічно було припустити, що білки-партнери для MPT63 можуть бути представлені на клітинах моноцитарного походження. Тому для проведення досліджень як модель було обрано лінію клітин гістіоцитарної лімфоми людини U937, що є класичною моделлю диференціювання моноцитів. Було виявлено, що МРТ63 специфічно зв’язується з субпопуляцією високогранулярних клітин лінії U937 (близько 3% від загального пулу), які, ймовірно, репрезентують популяцію клітин, що диференціювалися в бік макрофагального фенотипу. Подальші дослідження показали, що МРТ63 взаємодіє з окремою групою клітин селезінки миші, які характеризуються високим рівнем гранулярності, а отже, ймовірно, належать до певної субпопуляції макрофагів.
ВИСНОВКИ: Отримані результати дозволяють припустити, що на поверхні клітин моноцитарного походження на певній стадії диференціації з’являються молекули, з якими специфічно взаємодіє мікобактеріальний білок МРТ63, що робить цю популяцію клітин мішенню його впливу.
УДК 543.682:620.266.1
К.В. СТЕПУРСЬКА 1, О.О. СОЛДАТКІН 1,2, І.С. КУЧЕРЕНКО 1,2, О.С. БУРДАК 3, С.В. ДЗЯДЕВИЧ 1,2, О.П. СОЛДАТКІН 1,2
БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ АЦЕТИЛХОЛІНЕСТЕРАЗИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ РІЗНИХ КЛАСІВ ТОКСИКАНТІВ
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 64;
2 Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, вул. Заболотного 150, Київ;
3Національний університет харчових технологій вул. Володимирська, 68, Київ;
E-mail:
Останні роки екологічний моніторинг стає все більш актуальною проблемою. Це пов’язано зі стрімким розвитком хімічної промисловості та інтенсивним використанням різноманітних хімічних препаратів в сільському господарстві та інших галузях людської діяльності. Одним із перспективних напрямків досліджень для потреб екологічного моніторингу є біосенсорика, а саме розробка ферментних електрохімічних біосенсорів для визначення різноманітних токсикантів. Значний інтерес, який виявляється до біосенсорів сьогодні, зумовлений їх певними перевагами у порівнянні із традиційними методами аналізу: відносна дешевизна та простота використання при високій чутливості та специфічності. На сьогодні вже є немало повідомлень про біосенсорні системи на основі ацетилхолінестерази (АцХЕ), але при розробці таких систем виникає ряд труднощів. По-перше, деякі класи токсикантів інактивують фермент необоротно, тобто промивка буферним розчином не відновлює активності біоселективного елементу, це призводить до одноразового використання біосенсора, що в свою чергу ускладнює їх калібрування. По-друге, різні токсиканти, які містяться в реальних зразках, спричиняють інтерферуючий вплив, що ускладнює селективність аналізу. Ми пропонуємо вирішити ці проблеми за допомогою додаткового етапу – специфічної реактивації біоселективного елементу.
Основною метою даної роботи була розробка кондуктометричного біосенсора на основі АцХЕ для інгібіторного аналізу різних токсикантів та дослідження умов його специфічної реактивації. При розробці біосенсора, як кондуктометричний перетворювач використовувалася диференційна пара планарних золотих гребінчастих електродів, нанесених на ситалову підкладку. Роль біоселективного елементу відігравала АцХЕ, ко-іммобілізована з бичачим сиворотковим альбуміном поперечною зшивкою глутаровим альдегідом на поверхні перетворювача.
В роботі було перевірено чутливість розробленого біосенсора на основі АцХЕ до різних класів токсичних речовин (фосфорорганічних пестицидів, іонів важких металів, поверхнево-активних речовин та афлотоксину). Встановлено типи інгібування біоселективного елементу відповідними класами токсикантів (зворотнє та незворотнє). У випадку незворотного інгібування біосенсора, показано принципову можливість його реактивації різними реактиваторами (піридин-2-альдоксимметилйодид, ЕДТА та цистеїн) та проведено порівняльну характеристику цих реактиваторів. На основі отриманих результатів була запропонована методика біосенсорного визначення токсичних речовин різних класів в складних мультикомпонентних водних зразках.
Робота виконана за фінансової підтримки НАН України в рамках комплексної науково-технічної програми “Сенсорні прилади для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб: метрологічне забезпечення та дослідна експлуатація“ та Державного агентства України з питань науки, інновацій та інформатизації (в рамках Програми науково-технічного співробітництва між Урядами України і Республіки Індія на 2011-2013 роки).
УДК 579.222
О.О. ТІГУНОВА, С.М. ШУЛЬГА
ВИДІЛЕННЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЯ НОВИХ ВІТЧИЗНЯНИХ ШТАМІВ-ПРОДУЦЕНТІВ БІОБУТАНОЛУ
ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки» НАН України, Київ
E-mail:
Вступ
Дослідження ензиматичних процесів з метою отримання біопалива розвивається достатньо швидко. Головна риса сучасних тенденцій розвитку біопалив – використання біоетанолу та біобутанолу як перспективних видів моторного палива. Промислове біотехнологічне виробництво бутанолу було засновано на ферментації вуглеводної сировини (кукурудзяного борошна) бактеріями Clostridium acetobutylicum з отриманням, в основному, ацетону та бутанолу.
Метою даної роботи був пошук та ідентифікація штамів-продуцентів бутанолу і масляної кислоти, як попередника бутанолу,.
Методи
Для визначення належності відібраних культур бактерій до клострідіального типу проведено ідентифікацію з використанням розчину Люголю. Ампліфікацію генів 16S рРНК проводили за допомогою геномної ДНК клострідій та специфічних бактеріальних праймерів. Продукти ПЛР секвенували і аналізували нуклеотидну послідовність за допомогою пакетів програм BLAST та CLUSTALW. Концентрацію ацетону, бутанолу та етанолу у культуральній рідині аналізували за допомогою газової хроматографії.
Результати
Зразки для мікробіологічного аналізу відбирались з мулів та ґрунтів водойм м. Києва. Всі зразки були відповідно оброблені та досліджені протягом першої доби. В усіх зразках були виділені декілька груп бактерій, що мали форму рухливих паличок та містили гранульозу.
Були відібрані та ізольовані характерні колонії білого і сірого кольору та колонії з жовтим відтінком у формі “двояковипуклої лінзи”, “клаптика вати” або “літачка”. Навколо всіх колоній була зона просвітлення.
За результатами аналізу відібрано три штами, які були ідентифіковані за визначником Бердже. Показано, що культури відносяться до виду C. tyrobutyricum (штам IFCG C4В) – продуцент масляної кислоти, C. acetobutyricum (штам IFCG C6Н) та C. butyricum (штам IFCG C7Р) – продуценти бутанолу.
Проведено сіквенс за 16S рРНК та визначено нуклеотидні послідовності відібраних штамів. Порівняльний аналіз послідовностей з генами 16S рРНК бази даних GenBank показав, що гомологія з існуючими штамами склала близько 90%.
Висновки
Ідентифікація культур нових штамів-продуцентів біопалива – це перший крок на шляху розроблення технології одержання біобутанолу з основними технологічними етапами – збільшенням виходу біобутанолу та використанням дешевої відновлювальної сировини.
УДК 616.379-008.64: 611.018.53: 576.367
І.В. ФЕРЕНЦ, М.Я. ЛЮТА, І.В. БРОДЯК, Н.О. СИБІРНА
ЕФЕКТ АГМАТИНУ НА ПРОЦЕС АПОПТОЗУ ЛЕЙКОЦИТІВ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ
Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів;
Одним із проявів негативного впливу гіперглікемії при захворюванні на цукровий діабет є інтенсифікація процесів утворення вільних радикалів Оксигену та Нітрогену. На фоні порушення роботи системи антиоксидантного захисту організму ці сполуки виявляють значний ушкоджуючий вплив на компоненти клітини, зумовлюючи розвиток оксидативно-нітративного стресу. Пошкодження вільними радикалами молекули ДНК призводить до однониткових розривів, і, в кінцевому результаті спрямовує клітину на шлях апоптозу. Індукція апоптичних процесів у клітині супроводжується зміною гліканового профілю плазматичної мембрани лейкоцитів, що призводить до порушення сприйняття молекулярних сигналів із мікрооточення та впливає на характер їхньої взаємодії з іншими клітинами. Термінальну позицію у структурі олігосахаридних ланцюгів гліканів переважно займають сіалові кислоти. Відщеплення залишків цих цукрів супроводжується демаскуванням субтермінальної галактози/N-ацетилгалактозаміну, що відіграє ключову роль у впізнаванні та захопленні апоптичних лейкоцитів макрофагами.
Мета роботи полягала у дослідженні процесу апоптозу та ідентифікації змін у ступені сіалювання гліканових епітопів мембран лейкоцитів за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) у щурів при застосуванні як цукрознижуючого агента поліаміну агматину.
Детекцію ранніх проявів апоптозу лейкоцитів проводили за ступенем експонування фосфатидилсерину у зовнішньому ліпідному шарі плазматичної мембрани з використанням міченого флуоресцеїнізотіоціанатом анексину та пропідій йодиду, імуноцитохімічним методом визначали рівень проапоптичного білка р53. Загальний вміст сіалових кислот вимірювали за методом Ворена. Використовуючи сіалоспецифічні лектини MAA та SNA проводили диференціювання (?2?3)- та (?2?6)-зв’язаних залишків цих кислих цукрів. Ступінь експонування субтермінальної галактози/ N-ацетилгалактозаміну досліджували лектин-ферментним аналізом з використанням лектинів PNA, RCA та SBA.
Показано, що розвиток ЕЦД супроводжується збільшенням числа анексин-позитивних лейкоцитів, відзначено також зростання кількості клітин із підвищеним вмістом білка р53. Спостерігали зниження вмісту сіалових кислот, як (?2?3)- та (?2?6)-зв’язаних, та збільшення демаскування галактози в олігосахаридних ланцюгах лейкоцитарних глікокон’югатів. Зниження ступеня сіалювання глікоантигенів лейкоцитів може бути зумовлено підвищенням активності клітинних сіалідаз, чи бути наслідком перерозподілу поверхневих сіалоглікокон’югатів внаслідок блеббінгу мембрани в процесі апоптозу. При введенні тваринам з ЕЦД агматину спостерігали зниження кількості клітин з ознаками апоптозу та зростання ступеня сіалювання лейкоцитарних гліканів. Показано зниження експонування комплементарних лектину RCA галактозовмісних вуглеводних детермінант, проте кількість PNA-специфічних асіалогліканів незначно зростала. Ймовірно, пригнічення апоптозу лейкоцитів за умов ЕЦД на фоні введення агматину зумовлено як його гіпоглікемічною дією, так і здатністю цього поліаміну проявляти властивості скавенджера вільних радикалів та захищати мітохондрії від набухання й розриву, попереджаючи розвиток апоптозу мітохондріальним шляхом.
УДК 577.16+577.15:577.121
А.В. ХОМЕНКО1, Л.І. АПУХОВСЬКА1, М.М. ВЕЛИКИЙ1, В.М. ВАСИЛЕВСЬКА1, А.І. БЕЗУСЯК1, О.Ю. ЛОТОЦЬКА1, О.О. МАКАРОВА1, О.І. ПУСТОВАЛОВА2
ОСОБЛИВОСТІ ГІДРОКСИЛЮВАННЯ ХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛУ В ГЕПАТОЦИТАХ ЗА ДІЇ ПРЕДНІЗОЛОНУ
1Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
2ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології» АМН України, Київ.
Глюкокортикоїдна терапія супроводжується розвитком процесів, характерних для стероїдного остеопорозу. Опосередковані ефекти глюкокортикоїдів на кісткову тканину виявляються через порушення мінерального обміну, який регулюється вітаміном D3. У зв’язку з цим, метою роботи було дослідження впливу глюкокортикоїдного препарату – преднізолону на метаболізм холекальциферолу в печінці, а саме на процеси його гідроксилювання з утворенням 25-гідроксивітаміну D3.
Методи. Експериментальні тварини (щури-самки, 100±5 г) отримували преднізолон в дозі 0,5 мг на 100 г маси тіла (щодня протягом 30 днів, перорально). Вміст 25OHD3 в сироватці крові визначали методом імуноензимного аналізу (25-Hydroxy Vitamin D EIA). Активність вітамін D3 25-гідроксилази визначали в ізольованих гепатоцитах радіорецепторним методом з використанням [3Н]-25OHD3. Рівні ізоферментів вітамін D3 25-гідроксилази (CYP27A1, CYP2R1) визначали методом Вестерн-блот аналізу. Структурно-функціональний стан тканини печінки й гепатоцитів досліджували гістологічними та цитохімічними методами.
Результати. Показано, що преднізолон спричинює порушення метаболізму холекальциферолу в гепатоцитах, а саме пригнічує вітамін D3 25-гідроксилазну активність. Мікросомний (CYP2R1) та мітохондріальний (CYP27A1) ізоензими вітамін D3 25-гідроксилази гепатоцитів функціонують за різних концентрацій субстрату й відрізняються за вмістом у тканині печінки: відносний вміст CYP27A1 є вищим, ніж CYP2R1. За введення преднізолону зменшується вміст як мітохондріального, так й мікросомного ізоензимів вітамін D3 25-гідроксилази. Гальмування вітамін D3 25-гідроксилюючої системи гепатоцитів обумовлює значне зниження вмісту 25ОНD3 в сироватці крові. Такі зміни метаболізму холекальциферолу за дії преднізолону супроводжувались порушеннями структури і цілісності клітин печінки, що виявлялось у збільшенні кількості гепатоцитів з дистрофічними та дегенеративними змінами цитоплазми і ядер.
УДК 577.151.4
Т.А. ЯЦЕНКО, В.Н. РИБАЧУК, О.І. ЮСОВА
ДОСЛІДЖЕННЯ МЕХАНІЗМУ ФІБРИНОЛІЗУ І ЙОГО РЕГУЛЯЦІЇ НА МОДЕЛЬНИХ СИСТЕМАХ ЗА УЧАСТІ ПРОДУКТІВ ДЕГРАДАЦІЇ ФІБРИНУ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Молекулярний механізм фібринолізу передбачає локальне відокремлення плазміногену і його фізіологічного активатора від інгібіторів плазми шляхом специфічного зв'язування з фібрином, де відбувається активація плазміногену до плазміну з подальшим лізисом фібринового згустку. Під час лізису фібрину, ковалентно прошитого фактором XIIIa, утворюються проміжні високомолекулярні сполуки, що представляють собою ділянки протофібрил – (DDE)n, які гідролізуються до DDE-комплексів із подальшим утворенням корових фрагментів DD і Е3. Відомо, що (DDE)n, DDE-комплекс і DD-фрагмент інгібують полімеризацію фібрину. В той же час залишається не повністю з'ясованим механізм регуляції цими фрагментами фібринолітичного процесу та існування на їх молекулах центрів зв'язування профермента і тканинного активатора (tPA). В літературі існують суперечливі дані про стимуляцію активації плазміногена тканинним активатором в присутності продуктів гідролізу прошитого фібрину (Z.Budzynski, W.Nieuwehuizen).
Метою даної роботи є вивчення впливу проміжних та корових продуктів деградації фібрину на різні ланки фібринолітичного процесу: активацію плазміногена tPA та гідроліз фібрину плазміном.
Активацію плазміногена tPA в присутності фібрину (контроль) та фрагментів фібрину визначали за швидкістю вивільнення п-нітроаніліну з хромогенного субстрату S2251. Кінетика активації проферменту tPA свідчить, що (DDE)n, DDE-комплекс і DD-фрагменти фібрину є стимуляторами цього процесу, тоді як Е3-фрагмент не виявляє стимулюючих властивостей. Швидкість реакції активації в присутності (DDE)n і DDE-комплексу подібна такій як у випадку полімерного фібрину. Стимулюючий ефект DD-фрагменту складає близько 50% від ефекту фібрину. Дослідження впливу суміші фрагментів Е1Е2, отриманої при дисоціації DDE-комплекса, на реакцію активацію плазміногену показало, що Е1Е2 проявляє стимулюючий ефект. Вплив (DDE)n, DDE-комплексу та DD-фрагменту на активацію плазміногену tPA на фібрині та наступний гідроліз полімерного фібрину плазміном досліджували методом турбідиметрії. Отримані результати свідчать, що DD-фрагмент не впливає на Vmax лізису фібрину, в той час (DDE)n та DDE-комплекс зменшують швидкість лізису, проявляючи конкуренцію із фібрином за фермент.
Отримані дані про те, що ранні продукти гідролізу полімерного фібрину стимулюють активацію плазміногену tPA та зменшують швидкість лізису фібрину, свідчать про те, що на цих молекулах центри зв'язування проферменту та tPA ідентичні центрам зв'язування на фібрині.
Ефекторні властивості суміші фрагментів Е1Е2 свідчать про наявність центрів зв'язування плазміногена і tPA в Е-домені фібрину, що, можливо, підсилює дію DD-фрагменту до рівня (DDE)n та DDE-комплексу.