Шановні колеги, вітаю Вас! В Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України 11-го червня (вівторок) 2013 р. о 10-30 в Актовій залі відбудеться чергове засідання наукового семінару «Актуальні питання сучасної біохімії». Будемо слухати доповідь професора ЖОЛОСА Олександра Вікторовича (кафедра біофізики, Навчально-науковий центр “Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса Шевченка) «Регуляція рецептор-керованих та сенсорних TRP каналів». Як завжди, до цього листа додаємо файл із авторськими тезами доповіді. Будемо раді зустрітися з Вами та Вашими колегами на засіданні нашого семінару. З повагою – С.О.Костерін.
Регуляція рецептор-керованих та сенсорних TRP каналів фосфоліпідами клітинної мембрани О.В. Жолос
Кафедра біофізики Навчально-науковий центр “Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Тісні зв’язки між фосфоліпідами, зокрема фосфоінозитидами, і білками мембрани зараз добре відомі. Вони включають залучення ліпідів в регуляцію локалізації, переміщення, структури і функції білків. Найбільш детально дослідженими є процеси передачи сигналів, в яких фосфоінозитиди беруть участь або непрямим шляхом, або як субстрати для генерації потужних внутрішньоклітинних вторинних посередників (наприклад, синтез інозитол 1,4,5-трисфосфату, ІР3, і діацилгліцеролу, ДАГ, з фосфатидилінозитолу 4,5-бісфосфату, РІР2, при стимуляції фосфоліпази С, ФЛС), або як активатори інших сигнальних протеїнів. За останні 10-15 років була також сформульована нова концепція прямої дії ліпідів на мембранні білки, зокрема на іонні канали різних типів. Відомі та добре досліджені “мішені” для безпосередньої регуляції фосфоліпідами і в особливості РІР2 – це калієві канали вхідного випрямлення (Kir, саме вони були ідентифіковані першими), калієві канали М-типу (KCNQ, Kv7 канали), канали, які активуються гіперполяризацією і циклічними нуклеотидами (HCN і EAG/ERG) і потенціалзалежні кальцієві канали (особливо P/Q і N типів). Серед інших іон-транспортних білків добре досліджено активацію Са2+ насосу мембрани (PMCA) і Na+/Ca2+ обмінника (NCX1) при зв’язуванні РІР2.
Механізми прямої дії фосфоінозитидів поділяються на дозвільні (в тих випадках, коли функція канала або транспортера залежить від наявності певного ліпіда) та сигнальні (в тих випадках, коли зміна концентрації ліпіда динамічно регулює функцію протеїна). Яким з цих шляхів регулюється той чи інший іонний канал залежить головним чином від його афінітету по відношенню до ліпіду. Так, для протеїнів з високим афінітетом дозвільна регуляція є більш ймовірною, тоді як протеїни з низьким афінітетом мають більш високу чутливість до динаміки змін рівня фосфоінозитидів. Важливо відмітити і те, що афінітет протеїнів в свою чергу також може мінятися під впливом різних молекул та сигналів. Для більшості досліджених іонних каналів передбачається їх регуляція насамперед шляхом електростатичних взаємодій з ліпідами, але в деяких випадках така взаємодія може бути більш специфічною та відбуватися шляхом зв’язування РІР2 з доменами плекстринової гомології (РН домени). Детальна структура комплексів іонних каналів і фосфоліпідів залишається невідомою, тому і питання, яким саме чином досягається специфічність регуляції іонних каналів тим чи іншим фосфоліпідом залишається відкритим. Декілька поширених гіпотез включають існування мембранних мікродоменів для ліпідної регуляції, комплексів молекул (сигналоплекси) і конкуренції іонних каналів за молекули фосфоінозитидів. Остання передбачає механізм “детектора співпадіння” (coincidence detector) як найбільш універсальний і документований сценарій ліпідної сигналізації в регуляції функції іонних каналів.
Значна увага в цій галузі досліджень в останні 10 років була приділена ліпід-залежній регуляції неселективних Са2+-проникних катіонних каналів супер-родини TRP (Transient Receptor Potential), що включає 28 структурно подібних каналів (всі вони мають 4 субодиниці з 6 трансмембранними доменами в кожній) в організмі ссавців. Ці канали забезпечують сенсорний інтерфейс між зовнішнім і внутрішнім середовищем всіх клітин. Для виконання цієї функції TRP каналам притаманна полімодальна активація, тобто здатність відповідати на широкий спектр фізичних і хімічних стимулів – зміни в температурі, рН, осмотичності, потенціалі мембрани, концентрації різних іонів, механічні деформації, внутрішньоклітинні фактори тощо. Для принаймні 7 представників цієї родини зараз надійно встановлено, що в основі такої полімодальної регуляції лежить саме їх взаємодія з фосфоліпідами мембрани, і особливо з РІР2, який таким чином виступає в ролі універсального фактора модуляції активності TRP каналів.
Метою роботи було дослідження ліпід-залежної регуляції двох представників супер-родини TRP каналів - TRPC4 і TRPM8.
TRPC4. З використанням trpc4-/- мишей ми показали, що активація цього неселективного катіонного каналу лежить в основі холінергічного збудження гладеньких м’язів тонкого кишечнику. У всіх вісцеральних гладеньких м’язах експресовані два підтипи мускаринових холінорецепторів – М2 (80%) та М3 (20%), які активують Gi/o та Gq/11 протеїни, відповідно. Між цими рецепторами існує значний синергізм в активації деполяризуючих TRPC4 струмів, але молекулярні механізми такої тісної взаємодії між сигнальними шляхами довгий час лишалися невідомими. Наші попередні дослідження показали пряму участь Go білків в активації TRPC4, в той час як ні один із вторинних посередників в сигнальному каскаді Gq/11/ФЛС/ІР3-ДАГ не міг би виступати в такій ролі. Тому була досліджена можливість зменшення концентрації субстрату ФЛС, РІР2, в активації TRPC4. В міоцитах кишечнику експресовані дві ізоформи TRPC4 – повної довжини TRPC4? та коротший сплайс-варіант TRPC4?, в якому відсутні 84 амінокислотні залишки в цитоплазматичному С-кінці білку (С-?84). TRPC4? повністю блокувався при додаванні до розчину в петч піпетці коротшого і більш розчинного у воді аналога РІР2 (diC8-PIP2) в концентрації 20 мкМ, в той час як для TRPC4? цей ефект був відсутнім. Ефект був виключно специфічним, оскільки інші фосфоінозитиди (PI(3,4)P2, PI(3,5)P2 і PI(3,4,5)P3) і ІР6 не блокували, а деякі з них навіть активували TRPC4?. РІР2 зв’язувався з С-кінцем ?-, але не ?-ізоформи, in vitro. Блокування TRPC4? РІР2 залежало від асоціації TRPC4 з цитоскелетом клітини, оскільки цей ефект не спостерігався після обробки клітин цитохелазіном D або після видалення С-кінцевого PDZ-зв’язуючого домену (Thr-Thr-Arg-Leu), який необхідний для формування комплексу TRPC4 з F-актином через адапторні білки (NHERF/ERM). Зниження концентрації РІР2 в мембрані клітин шляхом їх обробки вортманіном (блокатор фосфатидилінозитол 4-кінази) та полі-L-лізином, який зв’язує РІР2 (РІР2 scavenger), не призводило до активації TRPC4?. Таким чином, було визначено ключову, селективну роль РІР2 в активації TRPC4? за принципом дозвільного механізму, що оперує в межах локального сигналоплексу, як це показано на запропонованій нами загальній схемі регуляції TRPC4. Специфічна взаємодія TRPC4 з РІР2 найбільш ймовірно відбувається через його РН-домен, який знаходиться в С-?84 фрагменті і який таким чином відсутній в TRPC4? ізоформі.
TRPM8. Цей канал найбільш відомий як рецептор ментолу і холоду (CMR1), який активується в сенсорних нейронах при температурах <28OC. В той же час, вперше він був клонований не з нейронів, а із передміхурової залози – органу, який не зазнає значних температурних коливань. Крім того, ми знайшли, що TRPM8 експресується в судинах з найбільшим рівнем експресії в аорті, де його активація холодом не може відбуватися за фізіологічних умов. Це поставило ряд проблемних питань щодо існування інших фізіологічних факторів, які могли б активувати TRPM8 в клітинах, в яких температурні зміни відсутні або незначні. В ряді робіт була визначена ключова роль РІР2 як кофактора, потрібного для активації TRPM8 холодом, але це могло пояснити активацію TRPM8 при фізіологічній температурі.
Ми експресували TRPM8 в НЕК293 клітинах і знайшли, що спустошення Са2+ запасників клітини шляхом блокування Са2+ насосу тапсігаргіном (ТГ) викликало значний вхід Са2+ через TRPM8 канали. Одним із відомих біохімічних механізмів активації депо-залежного входу Са2+ є сигнальна ланка з залученням Са2+-незалежної фосфоліпази А2 (іФЛА2). Кінцевими продуктами активації іФЛА2 є важливі ліпідні посередники – арахідонова кислота і лізофосфоліпіди (ЛФЛ), такі як лізофосфатидилхолін (ЛФХ) та лізофосфатидилінозитол (ЛФІ). Інгібітор ?-ізоформи іФЛА2 (S)-BEL в концентрації 10 мкМ пригнічував ТГ-індуковані TRPM8 струми на 45±6% (n=6), тоді як (R)-BEL, який є селективним блокатором ?-ізоформи іФЛА2, не впливав на активність TRPM8. Аналогічні результати були отримані при пригніченні активності іФЛА2 шляхом обробки клітин анти-сенс-нуклеотидами. Після ізоляції фрагментів мембрани із використанням конфігурації петч-клемп методу “inside-out” активність TRPM8 зменшувалася від рівня NPo 0,056±0,023 в конфігурації “cell-attached” до рівня NPo 0,010±0,002 в конфігурації “inside-out” (n=13) внаслідок припинення синтезу РІР2 в ізольованих фрагментах мембрани. Додавання до мембранних фрагментів ЛФХ або ЛФІ в концентрації 10 мкМ не тільки відновлювало активність TRPM8 до рівня його активності в інтактних клітинах, а і викликало додаткову потужну стимуляцію TRPM8. Цей ефект був зумовлений появою значної кількості тривалих відкритих станів каналу з середнім часом життя 7,9±2,4 мс (n=7), які звичайно не спостерігаються під час активації TRPM8 ментолом, холодом або деполяризацією мембрани (середній час відкритого стану у всіх цих випадках становить приблизно 1 мс). Таким чином, ми визначили принципово новий, біохімічний механізм активації TRPM8 через сигнальний шлях іФЛА2/ЛФЛ, який може бути основним при активації TRPM8 в тих органах, що не зазнають значних змін температури.