УДК 636.1:591.111
A.V. ANDRIICHUK1, H.M. TKACHENKO2, N.M. KURHALUK2, I.V. TKACHOVA1
EXERCISE-INDUCED CHANGES OF OXIDATIVE STRESS BIOMARKERS AND ANTIOXIDANT ENZYMES ACTIVITY IN SHOW JUMPING HORSES
1 Institute of Animal Breeding of National Academy of Agricultural Sciences, Kharkiv, Ukraine
e-mail:
2Department of Zoology and Animal Physiology, Department,
Institute of Biology and Environment Protection, Pomeranian University, Słupsk, Poland
e-mail:
The chronic exposure of regular training seems to improve of ability to adaptation and increased of antioxidant defense. However, the intense physical training imposed on equine athletes may lead to overtraining associated with oxidative stress. The purpose of the present study was to study the effect of intense exercise on level of oxidative stress biomarkers and antioxidant enzymes activity in well-trained Ukrainian warm blood horses involved in equestrian show jumping. Blood samples were collected from the jugular vein of eight horses (7-15 years old) into EDTA tubes at 2 time points: baseline at rest and after training session of jumping. The training session consisted of walk (5 min), trot (10 min), walk (5 min), gallop (15-20 min) with a series of jumps over obstacles height 80-120 cm, and walk (15 min). Oxidative stress biomarkers (2-hiobarbituric acid reactive substrates level, the carbonyl derivatives content of protein oxidative modification) and antioxidant defenses (superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, ceruloplasmin activity, total antioxidant capacity) were assessed. All statistical analyses were performed using Statistica 8.0 software (StatSoft, Poland).
Our results suggest that training session leads to different consequences on oxidative stress biomarkers in the blood, plasma, and erythrocytes of horses. Exercise induce in significant decrease of TBARS level in the blood and plasma by 55% and 28% (p<0.05), respectively. This difference in TBARS level between resting and training periods is a consequence of differing levels of oxidative stress occurring in the tissues and erythrocytes. Earlier study suggest thaterythrocytes are susceptible to oxidative damage as a result of the high polyunsaturated fatty acid content of their membrane and the high cellular concentrations of oxygen and hemoglobin are potentially powerful promoter to oxidative processes (ÇimenBurak, 2008). Significant reduce of aldehyde (by 72%, p<0.05) and ketonic derivatives level (by 61%, p<0.05) of proteins destruction in the erythrocytes after exercise indicates on exercise-induced adaptation. Exercise can induce the activity of the proteasome complex, which is significantly involved in the degradation of oxidatively modified proteins (Radak et al., 2008).The results of present study also showed an increase of superoxide dismutase by 49% (p<0.05), catalase by55% (p<0.05), and glutathione reductase by 113% (p<0.05), respectively. Elevated level of antioxidant defenses after exercise session may indicate about protective response of antioxidant enzymes against exercise-induced oxidative stress in sport horses.
In the present study the decrease of oxidative stress biomarkers in the blood and plasma in horses after training session could be attributed as adaptation to exercise and correlated with activation the antioxidant defense. Regular training session may cause to adaptive responses, and eventually leads to improvements in sports performance. It also can induce physiological effects most likely by increase the antioxidant homeostasis and ability to adaptation.
УДК 577.112.386:616.36-002-092.9
G.P. Kopylchuk, N.L.Borschovetska, I.M. Buchkovska
The Features of Cysteine Catabolism in Rat Hepatocytes Under Condition of Protein Deprivation and Acute Toxic Hepatitis
Chernivtsi National University named after Yuriy Fedkovych, Institute of Biology, Chemistry and Biological Resources, Chernivtsi
e-mail:
Sulfur-containing amino acids play an important role in maintaining the cellular systems integrity and redox potential, deactivation of free radicals, providing a pool of organic sulphates and methylation processes. Genetic and acquired defects of enzymes, regulating their metabolism, are associated with the disruption of liver metabolic processes and can provoke the development of hepatosteatosis, fibrosis, cirrhosis etc.
In order to study the features of cysteine catabolism under condition of protein deprivation, experimental animals were maintained on a low-protein semisynthetic diet for 28 days. Acute toxic hepatitis was modeled by per os paracetamol administration to rats at the dose of 1250 mg/kg (0,5 LD50) in the form of a suspension of 2% starch solution for 2 days.
The activity of key enzymes of cysteine metabolism in hepatocytes – cysteine dioxygenase (EC 1.13.11.20, CDO)and gamma-glutamylcysteine synthetase (EC 6.3.2.2, GCS)– was registered by the number of cysteine and inorganic phosphate (Pi). Desulfurase way of cysteine catabolism was evaluated in terms of hydrogen sulphide level.
In hepatocytes of animals, maintained either on a low-protein diet or subjected to paracetamol administration, two fold increase in CDO activity was determined compared to control values. However, the maximum values of this parameter were observed in protein deficient animals with paracetamol-induced hepatitis. It is known that CDO plays a key role in regulating the intracellular concentration of cysteine and its increase leads to CDO upregulation with a subsequent elevated formation of taurine and sulphates. Moreover the accelerated cysteine utilization may be accompanied with homocysteine accumulation with further development of hyperhomocysteinemia.
The activity level of GCS, catalyzing the ATP-dependent stage of glutathione (GSH) synthesis, was observed to be lower than control values in all experimental groups with a subsequent reduction of GSH level.
At the same time H2S hyperproduction occurs in blood serum of all experimental groups, which is known to be a powerful vasodilator under the physiological conditions. However under its excessive formation it can react with protein SH-groups, modifying their activity, form nitrosothiols and be nonenzymaticly oxidized with a formation of sulfites and sulfates.
Thus, protein deprivation and toxic hepatitis are accompanied with alteration in specific metabolism of sulfur-containing amino acids, including cysteine with the activation of desulfurasecatabolism pathway.
УДК 577.112
О.О. ВОРОНОВА, Н.В. КРИСАНОВА, Т.О. БОРИСОВА
ПРОТЕЇНКІНАЗА С-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ГЛУТАМАТНИХ ТРАНСПОРТЕРІВ ЗА УМОВ ЗНИЖЕННЯ ВМІСТУ ХОЛЕСТЕРОЛУ В НЕРВОВИХ ТЕРМІНАЛЯХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
e-mail:olgavoronova-93@yandex.ru
Глутамат є основним збуджуючим медіатором у центральній нервовій системі ссавців. Надлишкові його концентрації є токсичними, оскільки надмірна активація глутаматних рецепторів може призвести до загибелі нейронів. Поглинання глутамату нервовими клітинами забезпечується роботою високоафінних натрійзалежних глутаматних транспортерів, які локалізовані у плазматичній мембрані нервових клітин. Нещодавно було показано, що протеїнкіназа С є одним з потужних регуляторів транспортер-залежного накопичення глутамату нервовими терміналями головного мозку. Холестерол є важливим ліпідним компонентом біомембран, який у значній мірі визначає їх фізико-хімічні властивості. Він суттєво впливає на функціонування мембранних білків, входить до складу мембранних ліпідних мікродоменів. Зміни концентрації мембранного холестеролу призводять до модуляції активності транспортерів та рецепторів нейромедіаторів. Метою даної роботи було дослідити протеїнкіназа С-залежну регуляцію накопичення глутамату нервовими терміналями у нормі та за умов зниження вмісту холестеролу. У роботі використовували ізольовані нервові терміналі головного мозку щурів (синаптосоми). Видалення холестеролу здійснювали акцептором метил-β-циклодекстрином (МЦД). Показано, що інгібітор протеїнкінази С GF 109 203X (200 нМ) знижує початкову швидкість накопичення L- [14C]глутамату синаптосомами з нормальним вмістом холестеролу на ~ 15 %, що складає 2,5 ± 0,2 нмоль х хв-1 х мг-1білка в контролі та 2,17 ± 0,1 нмоль х хв-1 х мг-1білка за умов присутності інгібітору (P≤0,05, n=8, t-тест Стьюдента). За умов зниження вмісту холестеролу (на 25 %) з використанням 15 мМ МЦД (обробка синаптосом впродовж 30 хв при 37 оС) в присутності GF109 203X (200 нМ) початкова швидкість накопичення L-[14C]глутамату знижувалась з 1,5 ± 0,05 нмоль х хв-1 х мг-1білка до 1,4 ± 0,01 нмоль х хв-1 х мг-1білка. Акумуляція глутамату за 10 хв не змінювалась під дією GF109 203X як в контрольних синаптосомах, так і в холестерол-збіднених. Початкова швидкість накопичення L-[14C]глутамату синаптосомами зі зниженим вмістом холестеролу в присутності GF109 203X в середовищі інкубації в концентрації 200 нМ складала 93,2 ± 1,8 % від початкової швидкості без інгібітору, а в нормі цей показник складав 86,9 ± 2,0 % (Р≤0,05,n=5, t-тест Стьюдента, у порівнянні з контролем, прийнятим за 100 %). При використанні «нейтрального» комплексу MЦД-холестерол (1:0,15) не було зареєстровано суттєвих змін накопичення L-[14C]глутамату в порівнянні з контролем. Можна зробити висновок, що дефіцит холестеролу у нервових терміналях призводить до порушення протеїнкіназа С-залежного механізму регуляції активності глутаматних транспортерів.
УДК 616-006.213.3
О.І. ДЖУС1, А.В. БІЛЮК1, Т.В. НІКОЛАЄНКО1, В.В. НІКУЛІНА1, П.В. ГАРМАНЧУК1, Л.І. СТЕПАНОВА1
ЦИТОХРОМОКСИДАЗНА ТА СУКЦИНАТДЕГІДРОГЕНАЗНА АКТИВНІСТЬ В ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ НА РІЗНИХ ЕТАПАХ РОСТУ ТА МЕТАСТАЗУВАННЯ ПЕРЕЩЕПЛЮВАНОЇ КАРЦИНОМИ ЛЕГЕНІ ЛЬЮІС
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦ «Інститут біології» olena.dzhus@gmail.com
Вступ. Проліферація пухлинних клітин пов’язана з кисневим дефіцитом та локальною гіпоксією, що призводить до активації ферментів гліколізу, стимуляції експресії антиапоптичних білків та проангіогенних факторів. За таких умов відбувається порушення функції мітохондріальних ферментів, таких як сукцинатдегідрогеназа (СДГ) та цитохромоксидаза (ЦО). Метою даної роботи було визначення СДГ та ЦО активності в пухлинних клітинах на різних етапах росту та метастазування перещеплюваної карциноми легень Льюїс.
Матеріали і методи. Використовували зразки пухлин на 14-у, 19-у та 24-у добу після перещеплення карциноми легень Льюїс у мишей лінії С57Black. Отримання мітохондрій та внутрішніх мембран мітохондрій проводили згідно стандартних методик після гомогенізації пухлин методами фракціонування клітинних органел при різних коефіцієнтах седиментації. Сукцинатдегідрогеназну та цитохромоксидазну активність визначали за стандартними методами.
Результати. Дослідження показало, що на різних етапах розвитку пухлини змінюється активність як цитохромоксидази, так і сукцинатдегідрогенази. На 14-у добу активність ЦО становила 2,4±0,15 мкмоль окисненого цит.с/мг*хв, тоді як на 19-у добу зменшувалась в 1,4 рази, а на 25-у добу майже в 7 разів, порівняно з 14–ою добою, відповідно. Сукцинатдегідрогеназна активність також зменшувалась на 19-у та 25-у добу порівняно з 14-ою, однак не так виражено: 36,6±3,4; 25.0±1.6; 21.7±2.3 K3[Fe(CN)6]/мг*хв, на 14-у, 19-у та 25-у добу, відповідно.
Висновки. Отримані дані стосовно стану активності ферментів, які є компонентами дихальних комплексів внутрішньої мітохондріальної мембрани, вказують на зниження сукцинатдегідрогеназної та цитохромоксидазної активності в залежності від етапів пухлинного росту.
УДК 577.352.4
М.Є. ЄВТУШЕНКО,С.Г. ШЛИКОВ
ЗМІНИ КОНЦЕНТРАЦІЇ ІОНІЗОВАНОГО КАЛЬЦІЮ В КЛІТИНАХ МІОМЕТРІЯ ЩУРІВ ЗА ДІЇ АНТАГОНІСТІВ КАЛЬМОДУЛІНУ
Інститут біохімії імені О.В.Палладіна НАН України,Київ
e-mail:
Мітохондрії беруть участь в забезпеченні енергетичних потреб клітини, внутрішньоклітинного Са2+-гомеостазу, генерації та передачі електричних та кальцієвих сигналів, а також в індукції сигналу запрограмованої загибелі клітини. Величина мембранного потенціалу мітохондрій є суттєвим фактором регуляції акумуляції іонів Са у цих субклітинних структурах, що також позначається на концентрації цього катіона у клітині.
Попередні досліди з використанням потенціал чутливого флуоресцентного зонда TMRM показали, що антагоністи кальмодуліну спричиняють деполяризацію мітохондріальної мембрани. В даній роботі ми визначали зміну концентрації іонізованого кальцію в матриксі мітохондрій та в цитоплазмі клітин міометрія щурів за дії антагоністів кальмодуліну, кальмідазоліуму та трифлуоперазину. В роботі було використано дві експериментальні моделі: ізольовані мітохондрії та первинна культура клітин гладеньких м’язів матки щурів. Ефекти трифлуоперазину досліджувалися на фракції мітохондрій із використанням Са2+-чутливого зонда Fluo 4AM та методу флуоресцентної спектроскопії. З використанням методу конфокальної лазер-скануючої мікроскопіїї та Са2+-чутливого зонда Fluo 4AMбула визначена дія кальмідазоліуму на рівень іонізованого Са в гладеньком’язових клітинах міометрія щурів.
На фракції мітохондрій показано, що вміст іонізованого Са у матриксі мітохондрій становить 190нМ. Введення 100мкМ Са2+у середовище інкубації, що містить АТФ та іони Mg, супроводжується зростанням концентрації іонів Са (300нМ) в мітохондріях. За подальшого внесення 100мкМ трифлуоперазину спостерігається суттєве підвищення інтенсивності флуоресценції Са2+-чутливого зонда Fluo 4AMу мітохондріях, що свідчить про збільшення концентрації іонів Са всередині мітохондрій. Попередня інкубація мітохондрій з трифлуоперазином протягом 5 хвилин призводила до різкого зростання вмісту іонізованого Са в матриксі мітохондрій. Подальше введення100мкМ Са2+ у середовище інкубації супроводжується ще більшим підвищенням концентрації катіона у матриксі. Досліди на первинній культурі клітин міометрія показали, що інкубація клітин з антагоністом кальмодуліну – 10мкМ кальмідазоліумом, супроводжується збільшенням рівня іонізованого Са в цитоплазмі клітин.
Враховуючи раніше отримані результати, було зроблено висновок, що деполяризуючий вплив антагоністів кальмодуліну на мітохондрії міометрія супроводжується збільшенням рівня іонізованого Са як у матриксі мітохондрій, так і в цитоплазмі клітин.
Дані, що були одержані, вказують на участь кальмодуліну в контролі потенціалзалежного трансмембранного обміну Са2+ в мітохондріях міометрія щурів.
УДК 577.161.2:612.015.6
O.V. ZAITSEVA, S.G. SHANDRENKO, M.M. VELIKY
NITROSATIVE STRESS EFFECT ON THE CONDITION OF ALIMENTARY OSTEOPOROSIS IN RATS
Palladin Institute of Biochemistry NAS of Ukraine, Kyiv
e-mail:
Effect of induced nitrosative stress on the pathogenesis of alimentary osteoporosis is not fully established. Therefore the aim of the research was the investigation of nitrosative stress influence on the bone metabolism under alimentary osteoporosis development.
White male Wistar rats were used in the research. The experimental model of alimentary osteoporosis was performed by using of a synthetic diet without vitamin D3 combined with balanced content of calcium (1.2%) and phosphorus (0.7 %). Rats were divided into 3 groups. 1st - control rats were kept on vitamin D3 balanced diet, 2nd and 3rd groups were held on vitamin D3-deficiency diet for 45 days, additionally animals of 3rd group were intraperitoneal injected with 0.05 mg of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine for nitrosative stress development at 30 day of experiment. After decapitation at 45 day in blood samples were determined the level of NO with DAF-2DA by flow cytometry, total calcium, inorganic phosphate and alkaline phosphatase. Also osteometric and X-ray analyses were performed.
Results: in rats with alimentary osteoporosis level of NO in leukocytes was elevatedby 17% as compared to control. Level of alkaline phosphatase was also increased more than 2-fold (291±50 U/l) vs. control (134±22U/l). Total calcium and inorganic phosphate level was decreased by 23 % ((2.3±0.2) mmol/l, control (3.0±0.3) mmol/l) and 79% ((0.4±0.1) mmol/l, control (1.9±0.2) mmol/l) respectively.
In animals of 3rd group with nitrosative stress the level of NO in leukocytes was increased by 17%vs. 2nd group. It was also observed normalization of the main mineral parameters. Thus, the level of total calcium and inorganic phosphate was increased by 22% and 25% relatively, alkaline phosphatase level was decreased by 41% compared to 2nd group -osteoporosis.
Results of osteometric investigation indicated about significant development of osteoporosis. The femur decreased in weight and shortened in length by 47% and 32%, the vertical femoral head diameter decreasedby 14% compared to control. The X-ray studies showed some significant changes in the structure of experimental animal’s skeleton.
Obtained data indicate that vitamin D3 deficiency diet caused osteoporosis development. Induced nitrosative stress has a significant effect on mineral metabolism and on structure of rat’s skeleton with alimentary osteoporosis. High levels of NO inhibit bone resorption and normalize investigated parameters.
УДК 577.352.4
О. В. КОЛОМІЄЦЬ, Ю. В. ДАНИЛОВИЧ, Г. В. ДАНИЛОВИЧ
ВПЛИВ КАЛІКС[4]АРЕНІВ С-97 ТА С-99 НА ПОЛЯРИЗАЦІЮ ВНУТРІШНЬОЇ МЕМБРАНИ ТА Са2+/Н+-ОБМІН В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ
Інститут біохімії ім. О. В.Палладіна НАН України, Київ;
e-mail:
Потенціал на внутрішній мітохондріальній мембрані, який генерується завдяки роботі електрон-транспортного ланцюга, є важливою фундаментальною характеристикою мітохондрій (МХ). Поляризація мембрани МХ контролює роботу локалізованих в них катіон-транспортувальних систем, в тому числі і тих, що забезпечують трансмембранний обмін Са2+. Іони Са відіграють центральну роль у регуляції активності МХ. В основі підтримання оптимальної концентрації Са2+ в МХ лежить узгоджене функціонування систем енергозалежної акумуляції катіону та його вивільнення з матриксу в цитозоль, остання система представлена в клітинах гладенького м’язу Са2+/Н+-обмінником. Високоафінні низькомолекулярні ефектори Са2+/Н+-обмінника МХ відсутні. Втім, є підстави вважати, що такими сполуками можуть бути супрамолекулярні макроцикли калікс[4]арени.
Було досліджено вплив калікс[4]аренів С-97 та С-99 на рівень поляризації мітохондріальної мембрани інтактних міоцитів матки щурів із використанням потенціал-чутливого флуоресцентного зонду DiOC6(3). Із застосуванням лазерної конфокальної мікроскопії та специфічного щодо МХ барвника MitoTrackerOrangeCM-H2TMRos (200 нМ) доведено, що DiOC6(3) (100 нМ) взаємодіє із МХ. За допомогою методу протокової цитофлуориметрії та DiOC6(3) показано, що в умовах штучної деполяризації плазматичної мембрани уабаїном (1 мМ), сполуки С-97 та С-99 у концентрації 100 нМ викликають транзієнтне зростання мембранного потенціалу МХ, яке сягало 40 % від контрольного рівня і тривало біля 5 хв. Одержані результати підтверджуються даними лазерної конфокальної мікроскопії, згідно яких С-99 викликає суттєве зростання флуоресценції навантажених DiOC6(3) міоцитів, які були передінкубовані з уабаїном (1 мМ).
При дослідженні впливу С-97 та С-99 (100 нМ) наСа2+/Н+-обмін в ізольованих МХ міометрія за допомогою Са2+-чутливого флуоресцентного зонду Fluo-4 AM(2 мкМ) та методу спектрофлуориметрії показано, що С-97 та С-99 стимулюють досліджувану транспортну систему.
Проведені нами кінетичні розрахунки показали, що Са2+/Н+-обмін в МХ міометрія може здійснюватись зі стехіометрією 1:1, тобто мати електрогенну природу. Таким чином, його стимуляція дослідженими каліксаренами може лежати в основі зростання мітохондріального потенціалу.
Отже, калікс[4]арени С-97 та С-99викликають транзієнтне зростання мембранного потенціалу МХ, що може бути пов’язано із стимуляцією ними Са2+/Н+-обміну МХ.
Автори висловлюють подяку чл.-кор., д.б.н., професору Костеріну С.О. за наукову дискусію.
УДК 577.352.4
Ю.Ю. МАЗУР1, Т.О. ВЕКЛІЧ1, О.А. ШКРАБАК1, О.В. ЦИМБАЛЮК2
СЕЛЕКТИВНИЙ ІНГІБІТОР Са2+-ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ – КАЛІКС[4]АРЕН С-90 – ПІДВИЩУЄ КОНЦЕНТРАНЦІЮ Са2+ У МІОЦИТАХ МАТКИ ТА ПРИГНІЧУЄ РЕЛАКСАЦІЮ М’ЯЗЕВОГО СКОРОЧЕННЯ
1Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
2Інститут Високих Технологій КНУ ім. Тараса Шевченка,Київ;
ВСТУП. Mg2+, АТР-залежна Са2+-помпа плазматичної мембрани (ПМ) транспортує Са2+ з цитоплазми у позаклітинний простір та контролює локальні Са2+-сигнали у внутрішньоклітинних мембранних мікродоменах. Проте специфічний низькомолекулярний інгібітор Са2+,Mg2+-АТРази відсутній. Раніше нами було продемонстровано, що калікс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил-(фенілсульфоніліміно)метіламіно-25,26,27,28-тетра-пропоксикалікс[4]арен) претендує на роль селективного інгібітора Са2+,Mg2+-АТРази ПМ (І0,5= 20,2±0,5 мкМ, n = 5). Метою цієї роботи було дослідження закономірностей дії калікс[4]арену С-90 на внутрішньоклітинний Са2+-гомеостаз в гладеньком’язових клітинах (ГМК) матки та на їхню скоротливу активність.
МЕТОДИ. Активність Са2+,Mg2+-АТРази визначалася із використанням препарату ПМ міометрія свині методом визначення Рі, утвореного в результаті гідролізу АТР. Вплив калікс[4]арену на концентрацію цитоплазматичного Са2+ ([Ca2+]ц) визначали за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа LSM 510 META (зонд fluo-4 AM). Ефективний гідродинамічний діаметр (ГДД) ГМК визначали із застосуванням лазерно-кореляційного спектрометра (ЛКС) “ZetaSizer-3”.
Результати. Калікс[4]арен С-90 (≤ 50 мкМ) практично не впливав на спорідненість (КСа2+) та на коефіцієнт Хілла (nн,Са2+) по Са2+. При цьому максимальна швидкість гідролізу АТР Vmax,Са2+зменшувалася на 75 % відносно контролю ([C-90]=100 мкМ). Було досліджено вплив аналогів С-90, які відрізнялися за кількістю та розташуванням сульфоніламідинових груп на верхньому вінці калікс[4]аренового макроциклу. За інгібіторним ефектом аналоги можна розташувати в ряд: С-90 (має 4 амідинові групи) – І0,5=20,2±0,5 мкМ, С-716 (має 2 дистальні амідинові групи) – І0,5=53,4±3,5 мкМ, С-772 (має 2 латеральні амідинові групи) І0,5=168,3±21,1 мкМ (n =5). Отже, серед зазначених аналогів калікс[4]арен С-90 інгібує активність транспортної АТРази ПМ найбільш ефективно.
За допомогою конфокальної мікроскопії продемонстровано,що аплікація С-90 (20 мкМ) до ГМК, фіксованих на полі-L-лізині, викликає зростання [Ca2+]ц, яка з часом знижується до базального рівня. Також С-90 (50 мкМ), подібно до утеротоніку окситоцину, призводить до зменшення ефективного ГДД ГМК, виміряного за допомогою ЛКС, до 74 % відносно контролю, що свідчить про скорочення міоцитів. С-90 у якості інгібітора Са2+-помпи ПМ пригнічує релаксацію м’язевого скорочення в режимі реєстрації спонтанної активності смужок міометрія: на 20 % зменшується максимальна швидкість розслаблення, нормована на амплітуду скоротливої відповіді (Vmax).
ВИСНОВКИ. Зменшення Vmax,Са2+Са2+,Mg2+-залежного гідролізу АТР під впливом калікс[4]арену С-90 в поєднанні з відсутністю його впливу на КСа2+ свідчить про неконкурентний механізм інгібування вказаною сполукою ензиматичної активності. Інгібуючий ефект С-90 на Са2+,Mg2+-АТРазу пов’язаний з кооперативним впливом 4ьох трифторметилфенілсульфоніліминових груп, які односпрямовано орієнтовані на верхньому вінці калікс[4]аренового макроциклу. Зазначений інгібітор індукує збільшення [Ca2+]ц в міоцитах та скорочення ГМК, а також зменшує Vmaxрелаксації м’язевої напруги.
УДК 616-006.277.3
V.V. NIKULINA1, O.O. Zholob2, T.V. NIKOLAIENKO1, O.I. DZHUS1, S.I. ORYSYK2, L.V. GARMANCHUK1, O.V. SKACHKOVA3
PROAPOPTOTIC AND ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF [Pd(syn-A)Cl2] INHIBITOR ON CULTIVATED CELLS
1Taras Shevchenko National University of Kyiv, ESC “Institute of biology”, 2 Pr. Hlushkov, 03022, Kyiv, Ukraine,
e-mail:
2 V.I. Vernadskii Institute of General and Inorganic Chemistry NAS of Ukraine
3 National Cancer Institute, Kyiv, Ukraine
Introduction. Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) is a master regulator of hypoxic/ischemic vascular responses, driving transcriptional activation of many genes encoding angiogenic cytokines and growth factors involved in vascular reactivity, angiogenesis, and the mobilization and homing of bone marrow-derived angiogenic cells. HIF-1 activity manipulation is the perspective therapeutic approach which might overcome the current limitations of pro- and antiangiogenic medicine.
Materials and methods. Сell lineHeLa (humancervixcarcinoma) andMAEC (mouseendothelium) wereusedtodeterminethecytotoxic / cytostaticeffectsof [Pd(syn-A)Cl2] (wheresyn-A – (2Z)-2-(2-aminothiazole-4-yl)-2-hydroxyiminoaceticacid). Cells have been incubated with agent 6 for 24 hours under normal conditions in 96 well plates. Initial cell concentration was about 5х104 cells/ml in the sample volume of 100 µl. The number of living cells was determined using MTT-colorymetric test, cell counts wereperformed using a tripan blue. Apoptotic level and the distribution of cells in different phases of the cell cycle were assessed by flow cytometry.
Results. ComplexesofPd(II) withsyn-Ainduct apoptosis in both endothelial and tumor cells. However per cent of cells in G0/G1 phase was not changed in comparison with control, on the other hand cells redistribution has place in proliferative pool population: decrease in G2/M and increase in S-phase in the main target of angiogenesis – endotheliocytes, compared to control. We have detected that IC50 for HeLa cells was in concentration diapason 5х10-6-4.0х10-5М after the influence of metalcomplexe. The effect of complex reveals in right cytotoxic and antiproliferative impact. The level of apoptotic cells grew in two times in comparison with relevant control.
Conclusion. Thus, the mechanism of palladium complex [Pd(syn-A)Cl2], as HIF-1 inhibitor analog, reveal in significant proapoptotic effect that would be related with incomplete DNA replication in S-phase of cell cycle, because of cells accumulation in S-phase and G2/M population decrease was observed.
УДК 577.112:576.311.348:611.018.52
Я.М. РОКА-МОЙЯ1,С.І. ДІОРДІЄВА1, А.О. ГОРОШКО2, А.О. ТИХОМИРОВ1
ЗАЛУЧЕННЯ АКТИНУ, ЕКСПОНОВАНОГО НА ПОВЕРХНІ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ТРОМБОЦИТІВ, У ЗВ’ЯЗУВАННЯ ТА ПРОЦЕСІНГ ПЛАЗМІНОГЕНУ
1 Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України; yanulia@bk.ru
2 Київський національний університет ім. Тараса Шевченко
Вступ. Завдяки секреції низки медіаторів та факторів росту тромбоцити беруть участь у процесах регенерації тканин і відіграють важливу роль у розвитку ряду патологічних станів, таких як атеросклероз, серцево-судинні захворювання та пухлинний ріст. Ангіогенез залучається до патогенезу вказаних розладів та може модулюватися тромбоцитами, що впливають на хід захворювання. Ангіостатини (АС) є продуктами обмеженого протеолізу плазміногену (Плг), й відомі як потужні інгібітори ангіогенезу. Тромбоцити містять значні кількості протеїназ, які каталізують процес генерації АС. Однак, сайти зв’язування Плг, що залучаються до продукування АС на поверхні тромбоцитів, залишаються не визначеними. Мета даної роботи – встановити участь актину, що експонується на поверхні тромбоцитів, у зв’язуванні Плг та генерації АС в ході агрегації тромбоцитів in vitro.
Методи. Плг людини отримували за допомогою афінної хроматографії на Lys-сефарозі. Тромбоцити виокремлювали з плазми здорових донорів. Профілі агрегації відмитих тромбоцитів, активованих тромбіном (Тр) (0.2 – 1.0 NIH/мл), реєстрували з використанням оптичної агрегометрії. Протокову цитофлуориметрію застосовували для детекції експонованого актину на поверхні плазматичної мембрани Тр-активованих тромбоцитів, маркеру активованих тромбоцитів CD-62 (Р-селектину), зв’язування кон’югатів Плг-FITC з поверхнею тромбоцитів. Візуалізацію поверхневого актину тромбоцитів проводили із застосуванням конфокальної мікроскопії. Аналіз продуктів розщеплення Плг за присутності фракції плазматичних мембран інтактних та активованих тромбоцитів здійснювали за допомогою імуноблотингу.
Результати. Активація тромбоцитів Тр індукує експонування актину на поверхні плазматичної мембрани. Інтенсивність експонування актину залежить від концентрації агоніста та позитивно корелює з агрегативною активністю тромбоцитів та рівнем експресії CD-62. Встановлено, що активовані тромбоцити здатні більш ефективно зв’язувати Плг-FITC у порівнянні з клітинами, не обробленими Тр. Інкубація Плг з мембранною фракцією активованих тромбоцитів, на відміну від тієї, що була отримана з інтактних клітин, стимулює обмежений протеоліз даного білка. Утворені фрагменти Плг за молекулярною масою відповідають АС. Преінкубація активованих тромбоцитів з антитілами проти актину частково інгібує як зв’язування Плг-FITC з поверхнею клітин, так і деградацію Плг. Інгібітор серинових протеїназ p-NFGB повністю блокує фрагментацію Плг, що вказує на можливу роль плазміну у протеолізі Плг на поверхні активованих тромбоцитів.
Висновки. Вперше встановлено можливу роль актину, експонованого на поверхні тромбоцитів в ході їх активації, у зв’язуванні Плг. Доведено, що актин-опосередкована сорбція Плг є необхідною умовою для фрагментації Плг та утворення АС. Модуляція утворення АС тромбоцитами може бути перспективним напрямом терапії патологічних станів, асоційованих з порушеннями регуляції ангіогенезу.
УДК 577.112.3:616.33-006
M. TYMOSHENKO, O. KRAVCHENKO, O. BERNYK, L. OSTAPCHENKO
THE GLUTATHIONE CATABOLISM ENZYMES AND THE THIOREDOXIN REDUCTASE ACTIVITIES IN MUCOSA CELLS UNDER EXPERIMENTAL GASTRICCARCINOGENESIS
Educational and Scientific Centre «Institute of Biology»
Taras Shevchenko National University of Kyiv
e-mail:
There are two thiol redox systems found in cells – the thioredoxin reductase (TrxR)/thioredoxin complex and the glutathione reductase (GR)/glutathione complex. The main provider of reducing equivalent - NADPH, for both these redox systems is the glucoso-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). TrxR in conjunction with thioredoxin is a ubiquitousoxidoreductase system with antioxidant and redox regulatory roles.The main enzyme of the glutathione conjugates catabolism is the γ-glutamyl transferase (γ-GT). The glutathione and thioredoxin systems play a key role in protection of cellular macromolecules from damage due to reactive oxygen species, which enhanced production appears to be an important factor in the induction of cancer.
Thus, the aim of the study was to determine the activities of TrxR, GR, γ-GT and G6PD in gastric mucosa cells during the process of rat gastric cancer development.
Methods: the gastric carcinogenesis was initiated in 49 white male rats by 10-week replacement of drinking water by 0.01% solution of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, at the same time they were redefined on the diet containing 5% NaCl. After this period expiry the animals were fed with standard vivarium diet till the end of the 24th week. The gastric mucosa cells were extracted at the end of the 4th, 6th, 8th, 10th, 12th, 18th and 24th week. The standard spectrophotometric methods were used to determine the activities of investigated enzymes.
Results: The gastric mucosa cells were characterized by increased activity of TrxR for all research periods of carcinogenesis at average 2,4-fold over the control and the increased GR activity at average 1,4-fold from 6th to 24th week, except for the 10th week, when the decrease of GR activity at 1,5-fold was observed. Similarly, the activity of G6PD grew up at average 2,1-fold at the 4th, 6th, 12th and 18th week and reduced at 1,5-fold at the 10th week of gastric carcinogenesis compared to the control. Thus, the intensification of the antioxidant system functioning with the reducing processes prevalence was showed by the increased activities of TrxR, GR and their leading provider of renewable NADPH equivalents, – G6PD. At the stage of 4 th, 6 th, 8 th, 10 th and 24 th weeks of the gastrocarcinogenesis study there was an increase of γ-GT activity on the average at 1.4-fold in comparison to reference values.The obtained results gave the reason to suppose the principle significance of the joint disorders of glutathione and thioredoxin redox homeostasis in the development of gastric mucosa malignancy.
УДК 616.438-008.931:577.152.-02
K.O. TOKARCHUK, I.P. KRYSYUK, S.G.SHANDRENKO
THE DEVELOPMENT OF CARBONYL STRESS UNDER
EXPERIMENTAL DIABETES AND RHABDOMYOLYSIS IN RATS
Palladin Institute of Biochemistry NAS of Ukraine, Kyiv
e-mail:
Lipid peroxidation and non-enzymatic protein glycosylation are two main ways of endogenous aldehydes formation. These carbonyl compounds form post synthetic modifications in proteins and nucleic acids that lead to disruption their functions. The goal of this research was the investigation of carbonyl stress parameters formation under two rat’s experimental models: streptozotoсin-induced diabetes (STZD, carbonyl stress model) and glycerol-stimulated rhabdomyolysis (RM, oxidative stress model) and the using of medicine “Corectin 2” (Cor2), designed in our laboratory for decrease of carbonyl stress intensity. There were 4 groups of animals (n=8): gr. 1 – control; gr. 2 – STZD; gr. 3 – STZD+RM; gr. 4 – STZD+RM+Cor2. Gr. 2-4 were intraperitoneal injected with 1 ml of incomplete Freund's adjuvant and after 24 hrs with streptozotocin (STZ, 25 mg/kg) weekly for three times for STZD induction. Gr. 3-4 were injected with 50% glycerol solution (10 ml/kg) at 7 day after last STZ injection for RM induction. Cor2 (10% L-lysine, 8% L-glycine, 2.5 % N-acethyl-cysteine) was given to the gr. 4 (10 ml/kg/day) per os for 2.5 month.
Total aldehydes (purpald assay), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), protein CO groups (ELISA), low weight SH groups, and carboxymethyllysine (CML, ELISA) were determined.
Blood glucose level (27±8) mmol/l was accepted as diabetes vs. control (6.5±1.7) mmol/l at 7th day after last STZ injection.
Carbonyl stress development was proved by increasing of aldehydes level in plasma by 21% and in liver by 64%, of TBARS about 4 times in plasma and in liver, of CO groups by 33% and CML by 67% in plasma under STZD. Low weight SH groups were decreased in liver by 44%.
Under RM+STZD, the aldehydes level was decreased by 52% in liver, TBARS by 11% in liver, CO groups by 20% in plasma, CML by 11% in plasma vs. STZD. SH groups were increased by 20% in liver. These changes indicated that additional stimulation of RM in animals with STZD has significant influence for STZD development. We suggested that it can be associated with the antagonistic interaction between aldehydes formed during RM and STZD.
After Cor2 administration, the decreasing of aldehydes level by 50% in plasma and by 65 % in liver were observed. These effects may be resulted from overabundance of exogenous cysteine and lysine which form complexes with aldehydes and shield the biological targets. These changes led to decreasing of TBARS in 2.5 times in liver and in 3 times in plasma, of CML in 2 times in plasma vs. RM+STZD. SH-groups were increased by 23%.
Thus, designed medicine “Corectin 2” may be successfully used to decrease the carbonyl stress after-effects.
Keywords: aldehydes, diabetes, carbonyl stress
УДК 591.3:597.551.2.043:537-962+577.152.1
М. М. ЯРЕМЧУК, О. М. СЕМОЧКО, Д. І. САНАГУРСЬКИЙ
АКТИВНІСТЬ ЕНЗИМІВ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ ЗАРОДКІВ В’ЮНА ЗА ВПЛИВУ МІКРОХВИЛЬОВОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ
Львівський національний університет імені Івана Франка
вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна
e-mail:
Відомо, що радіочастотне електромагнітне випромінювання (РЧ ЕМВ) може призводити до порушення біохімічних процесів та нормального функціонування організму. Показано, що у відповідь на мікрохвильове випромінювання розвивається оксидативний стрес, збільшується кількість активних форм оксигену та знижується активність антиоксидантних ензимів. Тому, актуальним є дослідження впливу мікрохвильового випромінювання на активність ензимів антиоксидантної системи (АОС) зародків в’юна (Misgurnusfossilis L.).
В експериментах використовували зародки в’юна на різних стадіях розвитку – 2, 16, 64, 256 і 1024 бластомери. Ікру інкубували в розчині Гольтфретера. Отримані зиготи піддавали опроміненню на частотах мобільного зв’язку (900 МГц, SAR – 1,1 Вт/кг). Мобільний телефон перебував у режимі розмови та містився над досліджуваним об’єктом на відстані 3 см. Отримані зиготи опромінювали одноразово, відразу після запліднення протягом 5 і 10 хв з відбором зародків на досліджуваних стадіях. Визначали активність ензимів АОС – супероксиддисмутази (СОД) за методом В.А. Костюка, каталази (КТ), за методом М.А. Королюка та глутатіонпероксидази (ГП), за методом В.М. Моіна.
Встановлено, що вплив мікрохвильового випромінювання призводить до підвищення активності СОД (р≥0,95). Згідно з результатами наших досліджень на стадії 2 бластомерів активність СОД вища удвічі, порівняно з контролем. На стадії 16 бластомерів активність ензиму зростає на 40-50%, на стадії 64 бластомерів – 80-90%, а на стадії 8 поділу – 30-50%. Встановлено 1,5-2 разове зростання активності ензиму на стадії 10 поділу бластомерів, порівняно з контролем. На відміну від СОД, активність КТ у зародків в’юна, навпаки, знижується на стадіях 2, 16, 64 і 256 бластомерів за впливу ЕМВ, порівняно із відповідними показниками контрольної групи. Винятком є стадія 10 поділу, на якій відмічено дворазове зростання активності досліджуваного ензиму (р≥0,95). Також встановлено, що активність ГП знижується на усіх досліджуваних стадіях розвитку зародків за впливу мікрохвильового випромінювання. Найбільш чутливою до впливу ЕМВ виявилася стадія 64 бластомерів, на якій спостерігалось зниження активності ензиму на 65%, порівняно з контролем. Тенденція змін активності ГП, порівняно з активністю СОД і КТ, протилежна за напрямом.
Отже, вплив мікрохвильового випромінювання призводить до порушення функціонування ензимів АОС. На усіх досліджуваних стадіях розвитку істотно зростає активність СОД та вірогідно знижується активність ГПО і КТ. Винятком є зростання активності КТ на стадії 10 поділу (р≥0,95).