УДК 577.112
О. Б. ГОРБАТЮК1, М. В. ЦАПЕНКО2, М. В. ПАВЛОВА2
ОДЕРЖАННЯ ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ЗЛИТОГО БІЛКА SPA-CBD2 ТА ВСТАНОВЛЕННЯ ЙОГО ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;
2Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України, Київ
Сучасний рівень технологій рекомбінантних ДНК дозволяє клонувати цільові гени і забезпечувати їхню експресію в бактеріях E. coli. На сьогодні широко використовуються отримані в бактеріях білки або пептиди, які здатні селективно зв’язувати константні домени (Fc-домени) молекул імуноглобулінів. Серед них найбільш вживаним є білок А (SPA), який входить до складу клітинної стінки Staphylococcus aureus. Білок А складається з 5 високогомологічних доменів, кожен з яких здатний до специфічного зв’язування з Fc-домени імуноглобулінів різних видів ссавців.
При створенні афінних сорбентів для очищення імуноглобулінів на основі SPA його іммобілізацію здійснюють хімічним способом на BrCN-активованій матриці. Така іммобілізація є неспецифічною і вимагає суттєвих затрат на реагенти, відповідно собівартість таких сорбентів є високою. Генно-інженерне злиття ДНК-послідовності білка А з послідовністю целюлозо-зв’язувального домена (CBD), виділеного з целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum, забезпечує біоафінне зв’язування злитого білка з вуглеводневим остовом целюлози через домен CBD, орієнтовану іммобілізацію молекули білка на матриці та експонування центрів зв’язування SPA в положення, оптимальне для взаємодії з Fc-доменами імуноглобулінів.
Метою роботи було створення генно-інженерного злитого білка на основі стафілококового білка А та двох целюлозозв’язувальних доменів (SPA-CBD2), та встановлення його функціональних характеристик.
У роботі були використані наступні методи: конструювання рекомбінантних ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, електрофорез ДНК, секвенування ДНК, культивування і трансформація бактерій, експресія білків, електрофорез білків, виділення білків, афінна хроматографія.
Було проведено інтерактивний дизайн молекули рекомбінантного білка SPA-CBD2 та створено плазмідний вектор для його експресії у бактеріях E. coli. Визначені умови, які забезпечили суперпродукцію SPA-CBD2 в E. coli в розчинному стані. Показано функціональну активності білків-партнерів злитого білка SPA-CBD2 та стабільність при тривалому зберіганні. Показано перспективність використання отриманого гібридного білка для створення хроматографічного біоафінного сорбенту для очищення імуноглобулінів деяких видів ссавців.