УДК 577(112+352.46+354.9)+57(085.2+086.164)+616.931
А. Ю. ЛАБИНЦЕВ, Л. С. БАБІЦЬКА, Н. В. КОРОТКЕВИЧ, А. А. КАБЕРНЮК
РОЛЬ Т-ДОМЕНУ У ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОМУ ТРАФІКУ РЕКОМБІНАНТНИХ ФРАГМЕНТІВ ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСИНУ
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, м. Київ;
Дифтерійний токсин (ДТ) є основним фактором патогенності Corynebacterium diphtheriae та класичним представником білкових бактеріальних екзотоксинів групи АВ. Токсин представляє собою дві субодниниці А (SbА) та В (SbB), причому, SbB складається з двох доменів: рецептор-зв’язувального (R-домену) та транспортувального (Т-домену). R-домен ДТ взаємодіє з рецептором proHB-EGF на поверхні клітини та зумовлює інтерналізацію комплексу ДТ- proHB-EGF шляхом клатрин-опосередкованого ендоцитозу. Т-домен при зниженні рН середовища в ендосомі поступово починає входити в мембрану та опосередковує транспорт SbА до цитозолю клітини. SbА каталізує специфічну реакцію АДФ-рибозилювання фактору елонгації трансляції 2 еукаріот, що призводить до його інактивації та подальшої зупинки біосинтезу білка і загибелі клітини.
Не зважаючи на те, що механізм дії ДТ є добре відомим, окремі його етапи досі залишаються маловивченими. В першу чергу це стосується механізму реалізації транспортної функції Т-домену ДТ. Тому метою цієї роботи було дослідити роль Т-домену у внутрішньоклітинному трафіку ДТ за допомогою рекомбінантних флуоресцентних похідних фрагментів ДТ, а саме R-домену (R-eGFP) та SbB (R-домен разом з T-доменом) (mCherry-SbB) в експериментах на лінії клітин Vero із застосуванням методів проточної цитофлуориметрії та конфокальної мікроскопії.
Результати проточної цитофлуориметрії підтвердили, що обидва флуорисцентних похідних фрагментів ДТ (R-eGFP та mCherry-SbB) специфічно взаємодіють з рецепторами на поверхні клітин лінії Vero. Однак, кінетичні криві, що описують цю взаємодію, свідчать про знижену спорідненість R-домену порівняно з SbB до рецепторів на поверхні клітин. Результати конфокальної мікроскопії підтвердили проникнення обох білків всередину клітини. Передінкубація клітин Vero з R-eGFP та mCherry-SbB протягом різних проміжків часу дозволила спостерігати поетапно за входженням обох білків всередину клітини та їх транспортом в певні клітинні компартменти. Загальна схема транспортування R-eGFP та mCherry-SbB виявилась подібною, але транспорт R-eGFP відбувався значно швидше у порівнянні з mCherry-SbB (45 хв. для R-eGFP у порівнянні з 60-75 хв. для mCherry-SbB).
Ми припускаємо, що запізнення у транспорті mCherry-SbB порівняно з R-eGFP може бути обумовлене наявністю у складі mCherry-SbB Т-домену, який під час входження в мембрану ендосоми утворює канал і, таким чином, гальмує дозрівання ендосоми. Ймовірно, що затримка дозрівання ендосом є ще однією функцією Т-домену ДТ, яка забезпечує ефективну транслокацію SbА до цитозолю клітини.