УДК 577.112.7:576.32/36:616-006
Г. В. ПАСІЧНИК, О. І. БАСАРАБА, Н. В. КОЗЛОВА, Л. Б. ДРОБОТ
РОЛЬ АДАПТЕРНОГО БІЛКА Rukl/CIN85 У РЕАЛІЗАЦІЇ КЛІТИННИХ ЕФЕКТІВ 5?-ДИГІДРОТЕСТОСТЕРОНУ У КЛІТИНАХ АДЕНОКАРЦИНОМИ МАТКИ ЛЮДИНИ ЛІНІЇ HeLa
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна Національної Академії Наук України, Київ;
Дослідженнями останніх років встановлено, що однією з причин розвитку онкологічних захворювань є порушення функціонування численних сигнальних мереж клітин. Важливими компонентами сигнальних шляхів є адаптерні білки, до яких належить SH3-вмісний адаптерний білок Ruk/CIN85. Ruk/CIN85 має мультидоменну структуру і через зв’язування з низкою білків-партнерів формує мультимерні комплекси, залучені до таких клітинних відповідей як апоптоз, проліферація, регуляція функціонального стану актинового цитоскелету, інвазія та ін.
Результатами попередніх досліджень, що проводились у лабораторії сигнальних механізмів клітини, виявлено підвищення експресії Ruk/CIN85 у карциномах тіла та шийки матки людини.
Беручи до уваги важливу роль стероїдів у фізіології матки, зокрема андрогенів, вирішено було перевірити їх вплив на рівень експресії Ruk/CIN85 у клітинах шийки матки людини лінії HeLa.
Для досягнення поставленої мети клітини культивували за стандартних умов за наявності чи відсутності 5?-дигідротестостерону (ДГТ), лізували і отримували Тритон Х-100-розчинну фракцію. Потім проводили електрофорез у ПААГ за денатуруючи умов з наступним Вестерн-блот аналізом. Субклітинну локалізацію Rukl/CIN85 досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії.
У ході наших досліджень встановлено, що андрогеновий рецептор (АР) експресується в клітинах лінії HeLa, хоча і на значно нижчому рівні у порівнянні з таким у клітинах простати лінії LNCaP.
Нам не вдалося виявити змін у рівні експресії Rukl/CIN85 при тривалій стимуляції (1, 2, 3 доби) ДГТ. Водночас короткотривала стимуляція (2, 10 і 30 хв) приводила до значного зростання вмісту Rukl/CIN85 у Тритон Х-100-розчинних лізатах клітин, оброблених низькими концентраціями ДГТ (0,1 нМ та 0,01 нМ). Оскільки досліджувані лізати клітин не місять білків, жорстко асоційованих з цитоскелетом і ядерним матриксом, то підвищення вмісту Rukl/CIN85 в результаті дії ДГТ можна пояснити перерозподілом даного білка в клітині.
Для підтвердження нашого припущення про зміну субклітинної локалізації повнорозмірної форми Rukl/CIN85 була проведена конфокальна мікроскопія. За результатами аналізу нестимульованих клітин було виявлено часткову співлокалізацію між повнорозмірною формою Ruk/CIN85 і актином у нестимульованих клітинах лінії HeLa. Після стимуляції ДГТ спостерігається зміна патерну співлокалізації Rukl/CIN85 і актину з тенденцією до посилення співлокалізації у спеціалізованих зонах у примембранній області і, в деяких випадках у перинуклеарній зоні.
Дослідження субклітинної локалізації Rukl/CIN85 і АР показали, що у клітинах, стимульованих ДГТ, збільшується співлокалізація досліджуваних білків порівняно з нестимульованими клітинами.
Методом імунопреципітації показано, що ДГТ індукує утворення сигнальних комплексів, складовими яких є Rukl/CIN85, AР, p85? регуляторна субодиниця PI3-кінази, FAK і клатрин, залежно від часу дії та концентрації гормону.
На основі отриманих результатів щодо впливу ДГТ на субклітинну локалізацію Rukl/CIN85 та утворення комплексів між Rukl/CIN85 та АР, p85? регуляторною субодиницею РІ3-кінази, FAK і клатрином можна припустити, що Rukl/CIN85 залучений до регулювання швидких ефектів ДГТ у клітинах-мішенях.