577.112:577.15.08
В.О. ЧЕРНИШЕНКО
ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПОНОВАНОСТІ В?N-ДОМЕНУ ПРИ ПЕРЕХОДІ ФІБРИНОГЕНУ В ФІБРИН
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
Вивчення ролі послідовності В?N-домену (В? 1-53) в полімеризації фібрину, білок-білкових та білок-клітинних взаємодіях ускладнене значною структурною рухливістю цієї ділянки (Pechik, 2006, Doolittle, 2000).
З метою оцінки експонованості окремих фрагментів В?N-домену в молекулах фібриногену та фібрину ми дослідили доступність В?(1-53)-послідовності для гідролізу фібриногеназою із отрути Echis multisquamatis. Кінетичні параметри розщеплення фібриногеназою визначали за швидкістю утворення продуктів гідролізу R23-24 пептидного зв’язку. За спорідненістю фібриногенази до субстрату характеризували ступінь експонованості цього зв’язку в В?N-домені.
Спорідненість ферменту до субстрату та ефективність його дії визначали за кінетичними параметрами реакції гідролізу: Km, kcat та kcat/Km. Кінетичні криві будували за результатами денситометрії електрофореграм гідролізатів фібрин(оген)у фібриногеназою у програмі Totallab TL100. Досліджували кінетику гідролізу нативного фібриногену, полімерного та мономерного дезАА фібрину фібриногеназою.
У випадку гідролізу фібриногеназою нативного фібриногену отримали Km=8 ?М, kcat=0,13 с-1, kcat/Km=0,016 (mМ·с)-1; мономерного дезАА фібрину (за присутності GPRP, що повністю інгібував полімеризацію) Km=9,6 ?М, kcat=0,08 с-1, kcat/Km=0,0083 (mМ·с)-1; полімерного дезАА фібрину Km=60 ?М, kcat=0,041 с-1, kcat/Km=0,0007 (mМ·с)-1.
Оскільки у фібрилах полімерного дезАА фібрину для гідролізу доступні лише молекули фібрину, розташовані на їх поверхні, то для оцінки кінетичних параметрів ми розраховували їх концентрацію. Прийнявши діаметр фібрили за 85 нм (Weisel, 1986), діаметр перерізу циліндричної молекули фібрину за 6,5 нм (Hall, 1959) та припускаючи, що щільність молекул фібрину в фібрилі незмінна по всьому перерізу, відсоток доступних для гідролізу у фібрилі молекул фібрину становить 13,7 % від загальної концентрації дезАА фібрину. Оскільки у діапазоні вихідних концентрацій фібриногену від 1,4 до 4 mМ, використаних у наших дослідженнях, товщина фібрил суттєво не змінюється (Blomb?ck, 1989), то реальні кінетичні параметри гідролізу полімерного дезАА фібрину становитимуть Km=8,2 ?М, kcat=0,041 с-1, kcat/Km=0,005 (mМ·с)-1.
Таким чином, константа специфічності (Kcat/Km) реакції гідролізу дезАА фібрину фібриногеназою зменшується вдвічі для мономерного дезАА фібрину і утричі – для полімерного дезАА фібрину, порівняно з такою для фібриногену. Ці дані вказують на конформаційні зміни в ділянках NВ?-домену, прилеглих до R23-24 пептидного звязку, що знижують швидкість його розщеплення, при перетворенні фібриногену на дезАА фібрин та його наступній полімеризації. Ці зміни можуть бути пов''язані з відходом ?С-доменів, сполучених з фібринопептидами В або ж із залученням ділянок B?N-домену у взаємодію з Д регіоном молекули фібрину другої нитки протофібрили, що узгоджується з даними Budzynski, 1990 та Lugovskoy, 2007. Незмінна Km гідролізу фібриногеназою N-кінцевої ділянки В?-ланцюгів фібриногену у всіх трьох випадках вказує на стабільність структури даної послідовності, можливо, завдяки утворенню нею мікродомену (Pandya, 1985).