УДК 57.045:576.33
Л. О. КАСАТКІНА1,2, Т. О.БОРИСОВА1
ПРОТОННИЙ ГРАДІЄНТ СЕКРЕТОРНИХ ГРАНУЛ ТА ТРАНСПОРТ ГЛУТАМАТУ В ТРОМБОЦИТАХ ПРИ ЗНИЖЕННІ РІВНЯ МЕМБРАННОГО ХОЛЕСТЕРОЛУ
1Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
2Навчально-Науковий Центр «Інститут Біології», Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, Київ
Тромбоцити експресують високоафінні глутаматні транспортери (ЕААТ1-3) та рецептори глутамату (AMPA-, NMDA-, каїнатні рецептори). Передбачається роль глутамату як модулятора функціональної активності тромбоцитів. На мембрані секреторних гранул тромбоцитів виявлені везикулярні транспортери глутамату VGLUT1-2, які використовують протонний електрохімічний градієнт як рушійну силу транспорту.
Зниження протонного градієнта секреторних гранул тромбоцитів термодинамічно сприяє реверсному функціонуванню (транспорт у зворотному напрямі) везикулярних глутаматних транспортерів. Це може викликати вивільнення глутамату з секреторних гранул тромбоцитів в цитозоль, а при реверсії глутаматних транспортерів плазматичної мембрани, і в позаклітинний простір.
Був досліджений протонний градієнт секреторних гранул та транспорт глутамату в ізольованих тромбоцитах при зниженні рівня мембранного холестеролу. Як акцептор холестеролу ми використовували метил-?-циклодестрин (M?CD) – циклічний олігосахарид, який містить гідрофобну порожнину та гідрофільну поверхню. Зниження рівня мембранного холестеролу в тромбоцитах на 40 % під дією 15 мМ M?CD було показане методом лазерної скануючої конфокальної мікроскопії з використанням флуоресцентного зонду філіпіну.
Спектрофлуориметричні дослідження з використанням рН-чутливого флуоресцентного зонду акридинового оранжевого показали, що під дією 5 та 15 мМ M?CD спостерігається зниження протонного градієнта секреторних гранул тромбоцитів на 16 % та 56 %, відповідно. Збагачення плазматичної мембрани тромбоцитів холестеролом у складі комплексу M?CD-холесестерол (1:0,2) супроводжується додатковою акумуляцією акридинового оранжевого, що свідчить про підвищення активності протонної V-АТР-ази секреторних гранул. Досліджуючи активацію тромбоцитів методом проточної цитофлуориметрії та активність екзогенної глутаматдегідрогенази в суспензії тромбоцитів у присутності тромбіну (0,5 од./мл) показано вивільнення глутамату з секреторних гранул тромбоцитів. Водночас, зниження протонного градієнта секреторних гранул під дією 15 мМ M?CD не призводить до вивільнення глутамату з тромбоцитів. M?CD не викликає змін розміру та гранулярності цитоплазми тромбоцитів і не впливає на вивільнення глутамату шляхом екзоцитозу при активації тромбіном.
Встановлено, що M?CD викликає дисипацію протонного градієнта секреторних гранул тромбоцитів, не змінюючи здатність секреторних гранул до екзоцитозу та не викликаючи вивільнення глутамату з тромбоцитів шляхом реверсного функціонування везикулярних глутаматних транспортерів і/або транспортерів глутамату плазматичної мембрани.