УДК 577.152.3
С.В. МАРЧЕНКО1, О.А. НАЗАРЕНКО1, Е.К. КРАСЮК2, О.П. СОЛДАТКІН1
ПОТЕНЦІОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ РЕКОМБІНАНТНОЇ УРЕАЗИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ СЕЧОВИНИ
1Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ;
E-mail:
2Київський міський науково-практичний центр нефрології та гемодіалізу, Київ
Сечовина – головний і кінцевий продукт обміну білків. Рівень сечовини в крові є найкращим маркером роботи нирок, а її визначення – один з найпоширеніших тестів в рутинній клінічній діагностиці. Нормальний рівень сечовини в крові складає 2,5 – 7,5 мМ. За патофізіологічних умов цей показник може досягати 100 мМ. При концентрації сечовини 30 мМ хворому необхідно проводити гемодіаліз.
Як відомо, сечовина також широко розповсюджена в природі, тому її моніторинг є важливим в сільському господарстві, харчовій промисловості та охороні навколишнього середовища.
Традиційні методи визначення ґрунтуються на формуванні кольорових комплексів з сечовиною чи амонієм, що утворюється при гідролізі сечовини уреазою. Такі методи складні у використанні в зв’язку з цілим комплексом реакцій, на якому оснований аналіз, потребують попередньої пробопідготовки, непридатні для on-line вимірювань.
Методи.Біосенсорні методи на основі рН-чутливих польових транзисторів та іммобілізованої уреази прості, дешеві, точні, дозволяють проводити вимірювання в реальному режимі часу. Але, головним недоліком таких методів є вузький лінійний діапазон визначення сечовини, тому перед вимірюванням необхідно значно розводити біологічні зразки. Одним із шляхів вирішення даної проблеми є використання конкурентних інгібіторів уреази, наприклад, тетраборату натрію, або більш перспективний та придатний напрям для клінічної діагностики застосування рекомбінантної уреази [1].
Дана робота присвячена розробці потенціометричного біосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів та рекомбінантної уреази зі збільшеною Км (200 мМ) з наступною апробацією створеного біосенсора на реальних зразках.
Результати. В ході роботи відпрацьовані умови іммобілізації рекомбінантного ферменту у насичених парах глутарового альдегіду, підібрано рН-оптимум його роботи, визначено залежність величини відгуку іммобілізованої уреази від буферної ємності та іонної сили. Встановлено нижню межу чутливості розробленого біосенсора, яка складає 0,5 мМ та лінійний динамічний діапазони чутливості - 0,5-15 мМ. Підібрано оптимальні умови визначення сечовини в сироватці крові хворих на ниркову недостатність. Визначено невідому концентрацію сечовини в пробах крові та проведено порівняння з контрольним методом, показано добру кореляцію отриманих даних.
Висновки. Таким чином, розроблено потенціометричний біосенсор на основі рекомбінантної уреази і показано можливість його використання для контролю вмісту сечовини в сироватці крові хворих на ниркову недостатність.
A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault. A novel urea sensitive biosensor with extended dynamic range based on recombinant urease and ISFETs // Biosensor and Bioelectronics. – 2003. – № 19. – P. 131 – 135.