УДК 577.1:612.017.1:661.5:53.083.2
І.М. ЧУМАЧЕНКО
МЕТОДИ КОМПЛЕКСНОЇ ОЦІНКИ ОБМІНУ NO В ОРГАНІЗМІ.
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ;
E-mail:
Одним з найбільш поширених методів дослідження обміну NO в організмі є визначення концентрації його метаболітів – нітритів та нітратів. Однак, останні у значній кількості надходять в організм з екзогенних джерел, що обумовлює похибки при оцінці обміну NO.
Нами запропоновано принципово інший підхід для оцінки обміну оксиду азоту, що ґрунтується на використанні пастки NO (ДТК-Fe2+), що зв’язує NO з утворенням стабільного у фізіологічних умовах нітрозильного комплексу. Комплекс відмивається від фонової концентрації NO2 та NO3 . Кількість NO в комплексі визначається по кількості нітратів, що вивільнюється при кислотній дисоціації комплексу. На основі цього підходу розроблено комплекс методів для оцінки обміну NO.
1.Оцінка обміну NO в організмі тварини методом, що наближений до умов in vivo: тваринам за 40 хвилин до декапітації вводяться розчини: перитоніально - діетилдитіокарбамату натрію (ДТК) в дозі 500 мг/кг, підшкірно сульфат заліза 37,5 мг/кг та цитрат натрію 187,5 мг/кг; гомогенат тканини печінки готується на 10мМ фосфатному буфері рН 7,4 (1:5); білки осаджуються Ba(OH)2, ZnSO4; осад білків багатократно відмивається до відсутності залишків нітритів та нітратів у надосадовій рідині; до осаду білків додається соляна кислота до 1М; після центрифугування у надосадовій рідині визначається концентрація NO3 шляхом відновлення нітратів до нітритів на кадмієвій колонці з послідуючим визначенням спектрофотометричним методом за допомогою реактиву Грісса або флуоресцентним методом з 2,3-діамінонафталіном.
2. Визначення S-нітрозотіолів в сироватці крові ґрунтується на тому, що пастка NO (ДТК-Fe) здатна перехоплювати NO з S-нітрозотіолів. До 2мл сироватки крові додається 0,5 мл 100 мкМ ДТК та 0,5 мл 75 мкМ сульфату заліза; суміш інкубується 40 хвилин у темряві; осаджуються білки; подальший аналіз проводиться за схемою представленою в вищенаведеному методі.
3. Визначення NO-синтезуючої та нітритредуктазної активності in vitro.
До гомогенату печінки в якості субстрату додається або нітрит натрію (нітритредуктазна активність), або L-аргінін (NO-синтазна активність), а також розчини ДТК та сульфату заліза; інкубується 40 хвилин при температурі 37 оС; осаджуються білки; подальший аналіз проводиться за вищенаведеною схемою.
Розроблений метод дозволяє суттєво збільшити чутливість та специфічність визначення інтенсивності обміну NO в організмі.