КАЛІКС[4]АРЕН С-90 ЯК СЕЛЕКТИВНИЙ ІНГІБІТОР Mg2+,АТР-ЗАЛЕЖНОЇ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КЛІТИН МІОМЕТРІЯ

Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 13-го жовтня 2015 р. (вівторок) о 10-30 у Актовій залі Інституту відбудеться чергове засідання семінару. Будемо слухати доповідь аспірантки відділу біохімії м’язів Інституту біохімії МАЗУР Юлії Юріївни «КАЛІКС[4]АРЕН С-90 ЯК СЕЛЕКТИВНИЙ ІНГІБІТОР Mg2+,АТР-ЗАЛЕЖНОЇ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КЛІТИН МІОМЕТРІЯ». Мова йде за апробацію кандидатської дисертації. Як завжди, додаємо до цього листа файл із авторськими тезами доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою – С.О.Костерін.

КАЛІКС[4]АРЕН С-90 ЯК СЕЛЕКТИВНИЙ ІНГІБІТОРMg²⁺,АТР-ЗАЛЕЖНОЇ КАЛЬЦІЄВОЇ ПОМПИПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КЛІТИН МІОМЕТРІЯ

Мазур Юлія Юріївна, аспір. відділу біохімії м’язівї,

yuliya.vorona@gmail.com

Актуальністьпроблеми.Іони Ca є одними з ключових сигнальних сполук у клітинах усіх тканин. У гладеньком’язових клітинах (ГМК) іони Са є необхідними для активації скорочення, відповідно Са²⁺-транспортери залучені у процес контролю спряження скорочення/розслаблення. Єдиним високоафінним протеїном у системі видалення Са²⁺ із ГМК у клітинах ссавців є Mg²⁺,АТР-залежна Са²⁺-помпа (Ca²⁺,Mg²⁺-АТРаза, КФ 3.6.1.38) плазматичної мембрани (ПМ). Цей ензим відіграє ключову роль у внутрішньоклітинному гомеостазі Са²⁺, сигнальній трансдукції, а, у випадку ГМК, і в регуляції процесів скорочення/розслаблення. Зміни функціонування Са²⁺-помпи ПМ при різноманітних патологіях припускають важливу роль зазначеного протеїну в регуляції клітинного Са²⁺ як у збудливих, так і в незбудливих клітинах.

Використання високоспецифічних ефекторів до мембраннозв’язаних систем видалення іонів Са з цитозолю дозволить ґрунтовно вивчити біохімічні механізми електро- і фармакомеханічного спряження у м’язах, у тому числі у гладеньких м’язах (ГМ). Важливими є дослідження функціональних шляхів підтримання низької концентрації Са²⁺ в міоцитах у випадку захворювань ГМ матки, оскільки це дозволить краще розуміти фізіологію вказаного органу та розробити успішні підходи у діагностиці та лікуванні таких порушень репродуктивної системи, як передчасні пологи, дисменорея, тривалі пологи та слабка скоротлива активність матки (дистоція). На жаль, на сьогодні не відомі нетоксичні низькомолекулярні специфічні і афінні ефектори Са²⁺-помпи ПМ, які б використовувалися у фундаментальних дослідженнях скоротливої функції міометрія або в клінічній практиці.

Для застосування у медичних цілях останніми роками активно вивчаються каліксарени – макроциклічні сполуки фенолів, з’єднані метиленовими та сульфурними групами в 2 та 6 позиціях. На сьогодні описано багато біологічних властивостей каліксаренів: антивірусні, антибактеріальні, протипухлинні, антитромботичні, вони використовуються як транспортери лікарських препаратів. Беззаперечними перевагами каліксаренів є низька вартість та простота синтезу, можливість отримання продукту високого ступеня очистки. Практичне використання каліксаренів у біомедичній практиці також є досить перспективним з точки зору низької токсичності молекул, оскільки каліксарени не показали жодної активності в тесті Амеса.

У відділі біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ у співпраці з Інститутом органічної хімії НАНУ (член.-кор. НАНУ В.І. Кальченко та колеги) було показано, що калікс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил(фенілсульфониліміно)-метиламіно-25,26,27,28-тетрапропоксі-калікс[4]арен) у концентрації 100 мкМ селективно, на рівні ПМ, інгібував АТР-азну активність Са²⁺-помпи до ~ 25 % відносно контрольного значення. Тому нами було обрано саме цей калікс[4]арен для подальшого дослідження біохімічних особливостей його впливу на Са²⁺-транспортну Mg²⁺,АТР-залежну ензиматичну систему ПМ клітин міометрія, оскільки розробка специфічного і афінного інгібітора Ca²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ є питанням перспективним і актуальним як з фундаментальної, так і з прикладної точки зору.

Мета дослідження: дослідити біохімічні механізми дії калікс[4]арену С-90 на ензиматичну та транспортну активність Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ клітин міометрія.

1. Вивчити кінетичні закономірності інгібуючого впливу калікс[4]арену С-90 та його структурних аналогів на АТР-гідролазну активність Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ ГМК.
2. Дослідити вплив калікс[4]арену С-90 на транспортну активність Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ та концентрацію іонізованого Са²⁺ у клітинах міометрія.
3. Вивчити дію вищезазначеного інгібітора на Mg²⁺,АТР-залежний транспорт іонів Са за умов поляризації везикул ПМ (модель рівноважного потенціалу Гіббса-Доннана).

Методи дослідження:біохімії (препаративної та аналітичної, біохімічної мембранології, ензимології); оптичні (спектрофото- та спектрофлуориметрії, фотон-кореляційної спектроскопії, лазерної конфокальної та електронної мікроскопії); тензометрії (у співпраці з каф. біофізики КНУ ім. Тараса Шевченка та Інститутом фармакології та токсикології НАМН України); хімічної та біохімічної кінетики; математичного моделювання; статистичного аналізу.

Результати досліджень. У ході виконання роботи встановлено, що калікс[4]арен С-90 селективно (на рівні ПМ) пригнічує активність Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ (коефіцієнт інгібування І_0,5 20,2 ± 0,5 мкМ). Вказаний калікс[4]арен діє як повний неконкурентний інгібітор, оскільки практично відсутній його вплив на коефіцієнти спорідненості та кооперативності до йонів Са, Mg та АТР; втім, під впливом калікс[4]арену С-90 відбувається зниження максимальної швидкості ензиматичного гідролізу АТР. Для ефективної інгібіторної дії калікс[4]арену С-90 на Са²⁺,Mg²⁺-АТРазну активність має значення кількість та просторова орієнтація на верхньому вінці калікс[4]аренового макроциклу сульфаніламідних груп.

Показано, що калікс[4]аренам С-90 та С-107 притаманні мембранотропні властивості, протягом 15-20 с калікс[4]арен С-107 надходить у цитоплазму ГМК. Калікс[4]арен С-90 також знижує ензиматичний гідроліз АТР у випадку Са²⁺,Mg²⁺-АТРази саркоплазматичного ретикулума, але діє менш ефективно: він має вищий коефіцієнтт інгібування І_0,5, ніж у випадку Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ – 57,0 ± 1,5 мкМ. Доведено, що зазначений калікс[4]арен пригнічує транспортну активність Са²⁺,Mg²⁺-АТРази ПМ. Було розроблено модель формування рівноважного потенціалу у системі «везикули ПМ – середовище інкубації» на основі застосування потенціалу Гіббса-Доннана (E_D). За допомогою потенціал-чутливих флуоресцентних зондів доведено його формування в зазначеній системі та прокалібровано. У коротких проміжках часу (до 5 хв) дія зазначеного інгібітору не залежала від поляризації ПМ, але за тривалої інкубації ( ~ 10 хв) ефективність інгібуючого впливу калікс[4]арену С-90 змінювалася залежно від знаку поляризації на внутрішній поверхні везикул ПМ. Розроблена автором математична модель регуляції концентрації вільного Са²⁺ у незбуджених міоцитах ([Ca²⁺]_i) передбачала, що під впливом калік[4]арену С-90 (1-25 мкМ) [Ca²⁺]_iможе зростати в 2-3 рази, порівняно з станом спокою, тобто від 100 до 300 нМ. Дійсно, як вказують результати експериментальних досліджень з використанням конфокальної мікроскопії, зазначений калік[4]арен (50 мкМ) транзієнтно підвищував [Ca²⁺]_iу міоцитах на 45 % відносно контрольного значення.

Як і утеротонік окситоцин (100 нМ), калікс[4]арен С-90 (50 мкМ) викликав зменшення гідродинамічного діаметру міоцитів матки на 25 %, та зменшував швидкість релаксації м’язевого скорочення на 20%.

Одержані результати вказують на можливість використання калікс[4]арену С-90 – селективного інгібітора Mg²⁺,АТР-залежної Са²⁺-помпи ПМ – для подальшого вивчення біохімічних та біофізичних механізмів електро- та фармакомеханічого спряження в ГМ. Ці дані є перспективними для застосування калікс[4]арену С-90 (разом чи окремо з окситоцином) як фармакологічного препарату – регулятора скоротливої активності матки.