Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 27-го жовтня 2015 р. (вівторок) о 10-30 у Актовій залі Інституту відбудеться чергове засідання семінару. Будемо слухати доповідь н.с. відділу біохімії м’язів ІБХ к.б.н. Данилович Ганни Вікторівни «ОЦІНКА ФУНКЦІОНУВАННЯ ЕЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНОГО ЛАНЦЮГА ІЗОЛЬОВАНИХ МІТОХОНДРІЙ ГЛАДЕНЬКОГО М’ЯЗУ ЗА ФЛУОРЕСЦЕНЦІЄЮ NADH та FAD». Як завжди, додаємо до цього листа файл із авторськими тезами доповіді. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
З повагою – С.О.Костерін.
ОЦІНКА ФУНКЦІОНУВАННЯ ЕЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТУВАЛЬНОГО ЛАНЦЮГА
ІЗОЛЬОВАНИХ МІТОХОНДРІЙ ГЛАДЕНЬКОГО М’ЯЗУ ЗА ФЛУОРЕСЦЕНЦІЄЮ
NADH та FAD.
к.б.н. Данилович Ганна Вікторівна
АКТУАЛЬНІСТЬ. Мітохондрії відіграють центральну роль в енергетичному забезпеченні клітинного метаболізму, перемиканні шляхів загибелі клітини, термінації Са2+-сигналу. Електричний потенціал на внутрішній мітохондріальній мембрані є фундаментальною характеристикою мітохондрій, що відображає їхню функціональну активність..
Одним із широко вживаних засобів оцінки роботи мітохондрій є вимірювання швидкості споживання кисню суспензією цихорганел (або клітин) в різних функціональних станах методом полярографії. Але даний метод потребує специфічного обладнання та великої кількості експериментального матеріалу, та не дає інформації про біохімічні процеси, які лежать в основі змін споживання кисню мітохондріями. Таким чином, необхідним є пошук та розробка простих надійних та інформативних біохімічних підходів для оцінки активності окремих компонентів дихального ланцюга мітохондрій.
В останні роки набувають значення флуоресцентні підходи для оцінки функціонального стану мітохондрій, зокрема їхньої енергетики. Коензими NADH та FADН2 є первинними переносниками електронів при окислювальному фосфорилюванні. Однією з причин порушення дихання мітохондрій є зміни редокс-стану піридинових нуклеотидів, тобто балансу їх окисленої та відновленої форм. NADH та окислена форма FADН2 - FAD мають природну флуоресценцію, яка дозволяє “візуалізувати” їхній редокс-стан в живих клітинах та тканинах, з використанням оптичних методів без застосування флуоресцентних міток.
МЕТА. Систематизація та аналіз результатів власних досліджень зміни флуоресценції NADH та FAD як біомаркерів для оцінки функціонування мітохондрій (на прикладі тканини міометрія) за впливу інгібіторів електрон-транспортувального ланцюга та ефекторів іонного транспорту.
РЕЗУЛЬТАТИ. Показано, що флуоресцентний сигнал від FAD є протилежним від NADH за нормального функціонування електрон-транспортувального ланцюгу мітохондрій. Спрямований вплив інгібіторів І, ІІІ та ІV комплексів приводив до змін флуоресценції піридинових нуклеотидів. Ротенон (5 мкМ) викликав різке зростання флуоресценції NADH внаслідок інгібування комплексу І, не впливаючи на динаміку флуоресценції від FAD. Антиміцин А (1 мкг/мл) (інгібітор ІІІ комплексу) спричинював різке зростання флуоресценції NADH та помірне FAD порівнянно з контролем. Інгібітор ІV комплексу NaN3 (5 мМ) та протонофор СССР (10 мкМ) викликали зниження флуоресценції від NADH та FAD. Крім того, всі вищезазначені інгібітори призводили до набухання мітохондрій. Донори NO (0,1 мМ) спричинювали зміни флуоресценції піридинових нуклеотидів аналогічні впливу азиду натрію.
Енергозалежна акумуляція Са2+ в матрикс мітохондрій (за присутності субстратів окиснення та комплексу Mg-ATP2-) супроводжується суттєвим зниженням флуоресценції NADH та FAD з подальшим ростом сигналу, що, можливо, відбувається переважно за рахунок Са2+-залежної активації дегідрогеназ циклу Кребса.
Аналіз флуоресцентної відповіді NADH та FAD в суспензії ізольованих мітохондрій свідчить, що вплив калікс[4]аренів (100 нМ С-97, С-99, С-107) на функціональну активність електрон-транспортувального ланцюга може бути пов’язаний із пригніченням Са2+-залежних NAD-вмісних дегідрогеназ циклу Кребса та сукцинат-дегідрогенази.
ВИСНОВКИ. 1) Опрацьовано методичний підхід на основі власної флуоресценції піридинових нуклеотидів ізольованих мітохондрій гладенького м’язу як біомаркерів для оцінки функціонування електрон-транспортувального ланцюга. 2) Доведено, що аналіз флуоресцентної відповіді піридинових нуклеотидів дозволяє виявити наявність зворотніх зв’язків між рівнем енергізації мітохондрій, концентрацією Са2+ в матриксі та станом дихального ланцюга. 3) Каліксарени спроможні захищати мітохондрії від Са2+ - перевантаження і обмежувати функціонування електрон-транспортувального ланцюга.