Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 31 травня 2016 р. (вівторок) о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь аспірантки 3-го року навчання ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, провідного інженера відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Харькової Анастасії Павлівни. Tема доповіді: «ERN1-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ СИСТЕМИ IGF У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ». Авторські тези доповіді, як завжди, додаються. Запрошуємо Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
З повагою – С.О.Костерін.
ERN1-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ СИСТЕМИ IGF У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ
Доповідач: Харькова Анастасія Павлівна, аспірант 3-го року навчання ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, провідний інженер відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
Науковий керівник: Мінченко Олександр Григорович, доктор біологічних наук, професор
Актуальність теми. Процеcи проліферації, апоптозу та пухлиноутворення тісно пов'язані зі зміною клітинного гомеостазу, умовами гіпоксії, нестачею глюкози, амінокислот, оксидативним стресом тощо, що викликає в клітині комплекс реакцій відомих під загальною назвою стресу ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). Це є адаптивна реакція клітини на накопичення в люмені ЕР невірно згорнутих чи незгорнутих протеїнів внаслідок дії різноманітних стресових факторів. Ключовим та найбільш еволюційно консервативним сенсором стресу ЕР є сенсорно-сигнальний ензим ERN1 (endoplasmic reticulum to nuclei-1 signaling), активація якого за умов стресу ЕР врешті запускає експресію генів, продукти яких залучені до виведення клітини зі стану стресу. Участь ERN1 у регуліції пухлинного росту підтверджується тим фактом, що інгібування його активності має протипухлинні ефекти. Зокрема, G. Auf et al. (2013) показали, що клітини гліоми лінії U87 із повним пригніченням ERN1 характеризуються меншими розмірами, уповільненням росту, а також зниженням здатності до утворення пухлин на моделі ембріонів курчат, а пригнічення лише ендорибонуклеазної активності цього ензиму має ще більш виражені протипухлинні ефекти, але молекулярні механізми пригнічення пухлинного росту за інгібування ERN1 поки не є до кінця з’ясованими та потребують детального вивчення. Логічно припустити, що певну роль тут можуть грати секреторні фактори росту та протеїни, що регулюють їх активність. Однією з таких систем є система інсуліноподібного фактора росту – IGF (insulin like growth factor). Дослідження експресії генів, що кодують окремі компоненти системи IGF, та змін, що відбуваються в цій системі за умов пригнічення ензиму ERN1, дозволить з’ясувати їх можливу роль у регуляції проліферації клітин гліоми із залученням сигнальної системи ензиму ERN1. У майбутньому це може бути корисним для ідентифікації генів та/або протеїнів-мішеней для розробки нових підходів до лікування онкологічних захворювань.
Мета: дослідження експресії генів протеїнів, які входять до системи інсуліноподібного фактора росту, у клітинах гліоми лінії U87 за умов пригнічення функціональної активності ERN1, основного сенсорно-сигнального ензиму стресу ендоплазматичного ретикулуму, а також за дії гіпоксії, дефіциту глюкози або глутаміну у середовищі на експресію цих генів для з’ясування їх ролі в опосередкованому ERN1 контролі процесу проліферації клітин гліоми.
Методи дослідження: культивування клітин гліоми лінії U87 та її субліній, виділення тотальної РНК із культури клітин, спектрофотометричне визначення кількості РНК, електрофорез нуклеїнових кислот, синтез комплементарних ДНК методом зворотної транскрипції, полімеразна ланцюгова реакція, в тому числі кількісна полімеразна ланцюгова реакція для оцінки відносного рівня експресії генів на рівні мРНК, отримання цитозольних та ядерних фракцій протеїнів з культури клітин, осадження секреторних протеїнів з культурального середовища, спектрофотометричне визначення кількості протеїнів, електрофорез протеїнів у поліакриламідному гелі, аналіз протеїнів методом імуноблотингу, комп’ютерний аналіз результатів, отриманих за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції, статистичні методи обробки отриманих даних.
Результати. Вперше було показано, що експресія генів IGF-1, IGF-2, IGF-1R, IRS1, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6 та IGF2BP3, залежить від функціональної активності ензиму ERN1, та може грати певну роль у контролі процесів проліферації клітин гліоми. Встановлено, що рівень експресії генів основних пропроліферативних компонентів системи IGF (IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-2 та IGF2BP3) знижується при пригніченні ERN1, причому знижується також і рівень протеїнів IGF-2, IGFBP-2 та IGF2BP3. У той же час, рівень експресії генів антипроліферативних факторів IGFBP-3, IGFBP-4 та IGFBP-5 підвищується за умов пригнічення активності ензиму ERN1, причому IGFBP-3, як основний негативний регулятор проліферативної активності IGF, може відігравати ключову роль у пригніченні проліферації клітин гліоми за умов інгібування ензиму ERN1. Виявлено, що гіпоксія посилює експресію генів IRS2, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4 і IGFBP-6, але пригнічує експресію IGF-2 та IRS1, не впливаючи на рівень експресії генів IGF-1, IGF-1R і IGFBP-5. Вперше показано, що пригнічення ензиму ERN1 модифікує ефекти гіпоксії на експресію частини досліджених генів, а це свідчить про різні механізми гіпоксичної регуляції експресії генів системи IGF. Показано також, що за умов відсутності у поживному середовищі глутаміну або глюкози експресія гена IGFBP-3 залежить від активності ензиму ERN1. Аналогічні результати отримані для гена IGFBP-1 лише за умов відсутності глюкози. Для генів усіх інших IGFBP показано незалежність напрямку регуляції їх експресії за умов відсутності у поживному середовищі глутаміну або глюкози, від функціональної активності ензиму ERN1. Отримані результати допомагають визначити роль ключових регуляторних протеїнів і факторів росту системи IGF у ланцюжку подій, що пов’язують пригнічення функціональної активності сенсорно-сигнального ензиму стресу ЕР ERN1 та протипухлинні ефекти на рівні клітини, а також молекулярні механізми впливу гіпоксії та дефіциту глюкози та глутаміну на одну з основних сигнальних систем відповіді клітини на стрес ЕР – ензим ERN1.
Практичне значення роботи полягає в тому, що детальне вивчення молекулярних механізмів регуляції ключових факторів росту, їх рецепторів та регуляторних протеїнів необхідно для з’ясування механізмів контролю проліферації і виявлення перспективних генів-мішеней для розробки нових стратегій пригнічення росту злоякісних пухлин. Крім того, отримані результати вказують на взаємозв’язок сигнальної системи стресу ЕР з гіпоксією та дефіцитом поживних речовин в регуляції експресії генів, залучених до контролю процесів проліферації у пухлинах, що необхідно враховувати при розробці нових підходів до терапії злоякісних новоутворень.