Розробка технології посилення протипухлинної активності цисплатину за використання С60 фулерену

Шановні колеги, я вітаю Вас! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою діяльність. 10-го грудня (вівторок) 2019 р. о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь старшого наукового співробітника НДЛ “Синтез неорганічних сполук та матеріалів для нової техніки” хімічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка к.б.н. Прилуцької Світлани Володимирівни (e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.)  «Розробка технології посилення протипухлинної активності цисплатину за використання С₆₀ фулерену». Доповідь буде зроблено за матеріалами докторської дисертації. Як завжди, до інформаційного листа додаю авторські тези доповіді. Запрошую Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.

З повагою, щиро Ваш – С.Костерін.

Розробка технології посилення протипухлинної активності цисплатину за використання С₆₀ фулерену

Прилуцька Світлана Володимирівна (к.б.н., ст.н.с.), старший науковий співробітник НДЛ “Синтез неорганічних сполук та матеріалів для нової техніки” хімічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.)

Актуальність роботи. Цілеспрямований синтез наночастинок зі специфічними біологічними властивостями стимулював їх широке використання у біотехнологіях. Досліджено значну кількість наночастинок різної природи, зокрема, для поліпшення протипухлинної терапії та таргентної доставки лікарських препаратів. Серед таких наночастинок особливу увагу привертає представник карбонових наноструктур С₆₀ фулерен. Нанорозмірність (0,72 нм), сферичність, гідрофобність, біосумісність та біодоступність молекул С₆₀ забезпечують їх взаємодію з біологічними молекулами, вбудовування у ліпідний бішар мембрани та проникнення всередину клітин. Унікальною є будова поверхні молекули С₆₀ з системою π-кон’югованих подвійних зв’язків, що зумовлює здатність вловлювати вільні радикали та виявляти антиоксидантні властивості, а за умови фотозбудження після опромінення в УФ-Вид діапазоні продукувати токсичні АФК, що відкриває перспективи використання С₆₀ фулерену у фотодинамічній протипухлинній терапії. Крім того, наноструктура здатна утворювати комплекси з хіміопрепаратами, що може бути використано для оптимізації їх дії. Тому актуальним є пошук шляхів посилення ефективності протипухлинних препаратів за їх використання у комбінації з фотоактивованим С₆₀ фулереном, або у складі нековалентного комплексу з С₆₀ фулереном.

Мета роботи. Розробка технології застосування С₆₀ фулерену для посилення протипухлинної дії цисплатину in vitro та in vivo.

Завдання роботи:

1. Дослідити захисні властивості С₆₀ фулерену від ушкоджувальної дії пероксиду водню та цисплатину на нормальні клітини .
2. Дослідити проникнення С₆₀ фулерену у лейкозні клітини.
3. Оцінити комбіновану дію фотозбудженого C₆₀ фулерену та цисплатину на лейкозні клітини дикого типу та резистентні до цисплатину.
4. Створити та охарактеризувати нанокомплекс C₆₀ фулерену з цисплатином (С₆₀-Cis-Pt).
5. Оцінити протипухлинну дію нанокомплексу С₆₀-Cis-Pt in vitro та in vivo порівняно з окремою дією хіміопрепарату.

У роботі використано: стабільний водний колоїдний розчин С₆₀ фулерену (0,15 мг/мл, 5х10^-4 М), нормальні клітини (тимоцити та еритроцити щура), лінії клітин лейкозу L1210 і CCRF-CEM та карциноми легені LLC, модель трансплантованої карциноми легені Льюїс.

Методи дослідження: культивування клітин; світлова, фазово-контрастна, конфокальна мікроскопія; протокова цитофлуориметрія; спектрофотометрія та спектрофлуориметрія; динамічне розсіювання світла; сканувальна тунельна мікроскопія; комп’ютерне моделювання; визначення напівлетальної дози (LD₅₀), методи експериментальної онкології – оцінка показників пухлинного росту, метастазування, виживаності мишей-пухлиноносіїв; статистичний аналіз.

Результати роботи. Встановлено, що преінкубація з 10 мкМ С₆₀ фулереном запобігала продукуванню АФК тимоцитами, спричиненому як 100 мкМ пероксидом водню, так і 3,3 мкМ цисплатином, Н₂О₂-індукованому зниженню життєздатності тимоцитів та Cis-Pt -індукованому гемолізу еритроцитів.

З використанням флуоресцентно-міченого С₆₀ фулерену (С₆₀–RITC) доведено його поглинання та довготривале утримання лейкозними клітинами L1210. Імуноцитохімічне фарбування з використанням FITC-мічених антитіл до молекули C_60, барвників DAPI і MitoTracker Orange продемонструвало накопичення молекул С₆₀ у мітохондріях лейкозних клітин CCRF-CEM.

Показано, що за умови фотозбудження поглинутого лейкозними клітинами С₆₀ фулерену (опромінення світлодіодною лампою потужністю 100 мВт/см², 410-700 нм) спостерігається значна інтенсифікація продукування АФК, підвищення концентрації цитозольного Са²⁺, падіння мітохондріального потенціалу та накопичення клітин у проапоптичній SubG1 фазі. Встановлено, що за комбінованої дії фотозбудженого С₆₀ фулерену та Cis-Pt у низькій концентрації токсичний ефект протипухлинного препарату у лейкозних клітин L1210 дикого типу посилювався, а у резистентних до цисплатину клітинах L1210R – відновлювався, про що свідчило зниження життєздатності клітин внаслідок індукції апоптозу.

Вперше створено та охарактеризовано нековалентний, стійкий у водному середовищі (дзета-потенціал -21,2 мВ) нанокомплекс С₆₀ фулерену з Cis-Pt (C₆₀-Cis-Pt). Комплексоутворення між поодинокими молекулами С₆₀ та Cis-Pt підтверджено методами комп’ютерного моделювання, сканувальної тунельної мікроскопії та динамічного розсіювання світла. Середній гідродинамічний розмір наночастинок С₆₀-Cis-Pt комплексу становив 120 нм.

Встановлено, що токсична дія C₆₀-Cis-Pt нанокомплексу порівняно з окремою дією цисплатину на клітини карциноми легені Льюїс (LLC) in vitro була потужнішою, виявлялась у більш ранній період та за таких еквівалентних концентрацій хіміопрепарату, за яких він не впливав на життєздатність клітин. Величина ІС₅₀ для Cis-Pt-С₆₀ нанокомплексу через 72 год інкубації з клітинами була у 4,5 разів нижчою порівняно з ІС₅₀ для цисплатину окремо. За дії C₆₀-Cis-Pt нанокомплексу більшою мірою порівняно з окремою дією Cis-Pt пригнічувалась міграційна активність клітин LLC та посилювались такі ознаки апоптозу, як активація каспази 3/7 та вміст клітин, пофарбованих FITC-міченим анексином-V/РІ.

Вперше досліджено гостру токсичність немодифікованого С₆₀ фулерену та C₆₀-Cis-Pt нанокомплексу за умови внутрішньочеревного введення мишам. Високе значення LD₅₀ для C₆₀ фулерену (721 мг/кг) підтверджує відсутність у організмі тварин токсичних ефектів наноструктури за її використання у низьких дозах. Показано, що токсичність Cis-Pt (LD₅₀=15,6 мг/кг) за умови внутрішньочеревного введення мишам у комплексі з С₆₀ фулереном знижувалася (LD₅₀=36,1 мг/кг).

C₆₀-Cis-Pt нанокомплекс за дози 7,5 мг/кг (3,75 мг/кг С₆₀ та 3,75 мг/кг Cis-Pt) ефективніше пригнічував ріст перещепленої карциноми легені Льюїс та утворення метастазів у легенях мишей порівняно з дією Cis-Pt за еквівалентної дози. Виявлений протипухлинний та антиметастатичний ефект C₆₀-Cis-Pt нанокомплексу супроводжувався подовженням тривалості життя мишей-пухлиноносіїв, нормалізацією їх маси тіла та показників крові.

Обговорюються можливі механізми посилення протипухлинної дії цисплатину за умов комбінованої дії хіміопрепарату і фотозбудженого С₆₀ фулерену та за використання C₆₀-Cis-Pt нанокомлексу.

Висновки. Результати дослідження свідчать про перспективність використання С₆₀ фулерену для підвищення протипухлинної дії традиційних хіміопрепаратів. Запропоновано технологію посилення чутливості пухлинних клітин до дії цисплатину з використанням фотодинамічного потенціалу С₆₀ фулерену. Доведено ефективність застосування нековалентного C₆₀-Cis-Pt нанокомплексу для ушкодження пухлинних клітин та оптимізації дії протипухлинного препарату на організменному рівні.