Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України продовжує свою діяльність. 1-го лютого (вівторок) 2022 р. о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь н.с. відділу сигнальних механізмів клітини нашого Інституту к.б.н. Горак Ірини Романівни «Адаптерний протеїн Ruk/CIN85: системний регулятор транскриптомного й метаболічного репрограмування пухлинних клітин». Традиційно до листа додаємо авторські тези доповіді.
Запрошую Вас та Ваших колег до участі у роботі нашого семінару.
В А Ж Л И В О ! ЯК ЗАВЖДИ, УЧАСТЬ У РОБОТІ СЕМІНАРУ БЕЗПОСЕРЕДНЬО В ЗАЛІ МОЖЛИВА ВИКЛЮЧНО ЗА УМОВ ВИКОРИСТАННЯ МАСКОВОГО РЕЖИМУ ТА ДИСТАНЦІЙНОГО РОЗТАШУВАННЯ ПРИСУТНІХ У ПРИМІЩЕННІ. ДЯКУЮ ЗА РОЗУМІННЯ !
Співробітники відділів також будуть мати можливість приймати участь у роботі семінару ДИСТАНЦІЙНО в системі ZOOM, логін і пароль будуть надіслані додатково.
З повагою – С.О.Костерін.
Адаптерний протеїн Ruk/CIN85: системний регулятор транскриптомного й метаболічного репрограмування пухлинних клітин
к.б.н. Горак Ірина Романівна,
н.с. відділу сигнальних механізмів клітини
Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
Актуальність. Внутрішньопухлинна гетерогенність і пластичність – це ті ключові властивості, які забезпечують виживання пухлинних клітин і резистентність до протипухлинної терапії. Пластичніть пухлинних клітин тісно пов’язана не лише з генетичними та епігенетичними змінами, а й з модифікацією клітинного метаболізму і сигналювання. Водночас, у наших попередніх дослідженнях було показано, що високий рівень експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85 асоційований з посиленням злоякісних ознак пухлинних клітин, таких як рухливість, інвазивність, метастазування, стійкість до протипухлинних препаратів. Метою цього дослідження було оцінити зміни в транскриптомі, метаболізмі та сигналюванні карциномних клітин залежно від рівня експресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85.
Методи. Експерименти здійснювали з використанням клітин грудної залози (ліній 4Т1, MCF-7) і легені (лінії LLC) з різними рівнями експресії Ruk/CIN85. Рівні експресії мРНК оцінювали за допомогою ПЛР в реальному часі, вміст протеїнів – методом Вестерн-блот аналізу. Активності ензимів та вміст метаболітів визначали флуориметрично або спектрофотометрично. Вміст мітохондрій, мембранний потенціал мітохондрій, та продукування активних форм кисню (АФК) оцінювали методом протокової цитофлуориметрії. Міграційний потенціал клітин аналізували за допомогою тесту на заростання подряпини in vitro. Життєздатність пухлинних клітин оцінювали за допомогою прямого підрахунку клітин, МТТ-тесту, тесту на формування колоній в моношарі клітин та за умов культивування в напіврідкому агарі.
Результати. В результаті вимірювання рівнів експресії мРНК понад 100 генів, було встановлено, що надекспресія Ruk/CIN85 в клітинах лінії 4Т1 (4T1 RukUp) супроводжується посиленням експресії низки генів-маркерів епітелійно-мезенхімного переходу (ЕМТ), зокрема транскрипційних факторів, котрі індукують ЕМТ, віментину, урокінази, лізилоксидаз, низки прозапальних генів, молекулярних маркерів ракових стовбурових клітин (CSCs) і репрограмування. В той же час, у клітинах 4T1 RukUp спостерігали суттєве зниження рівня експресії генів, що кодують молекули адгезії, ензими, залучені до деградації позаклітинного матриксу (зокрема, Mmp2 i Mmp9), та регулятори проліферації. З іншого боку, нокдаун адаптерного протеїну Ruk/CIN85 (сублінія 4T1 RukDown) супроводжувався протилежними за напрямком змінами в рівнях експресії ключових генів. Подібні дані було одержано на моделях клітин ліній MCF-7 і LLC з різними рівнями експресії Ruk/CIN85. Також, було виявлено, що знижений рівень експресії та активності Mmp-2 та Mmp-9 разом з посиленням експресії й активності лізилоксидаз, зміною динаміки актинового цитоскелету є свідченням домінування амебоїдного типу міграції клітин 4Т1 RukUp. В той же час показано, що низький інвазивний потенціал клітин 4T1 RukDown на фоні зростання експресії й активності Mmp-2 та Mmp-9 може бути пояснений посиленим утворенням ангіостатинів.
Продемонстровано, що клітини 4Т1 RukUp характеризуються посиленим поглинанням глюкози, зростанням рівнів експресії та активності ензимів гліколізу (в тому числі лактатдегідрогенази), а також пентозофосфатного циклу (глюкозо-6-фосфат дегідрогенази), та значним пригніченням експресії й активності ензимів ЦТК, вмісту мітохондрій та мембранного потенціалу. На противагу цьому, для клітин сублінії 4T1 RukDown було виявлене достовірне зростання експресії та активності ензимів ЦТК (малатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази). На моделях клітин ліній 4Т1, MCF-7 і LLC було продемонстровано, що високий рівень експресії Ruk/CIN85 асоційований з посиленим продукуванням АФК, тоді як пригнічення рівня експресії цього адаптера супроводжується різким зниженням здатності продукувати АФК.
Показано наявність активованих Erk 1/2, p65(NF-κB) mTOR, Src у клітинах 4Т1 RukUp, причому при дії епідермального фактора росту (EGF) спостерігали більш тривалу і потужну активацію цих сигнальних шляхів, на відміну від контролю. У зв’язку з надактивацією вказаних шляхів в клітинах сублінії 4Т1 RukUp, застосування EGF супроводжувалось посиленням рухливості контрольних клітин та 4T1 RukDown, але не 4Т1 RukUp. Було з’ясовано, що інгібітори РІ3К, NOX і, найбільшою мірою, Src пригнічували рухливість 4Т1 RukUp та контрольних клітин.
На моделях клітин ліній 4Т1, MCF-7 і LLC було показано, що високий рівень експресії Ruk/CIN85 необхідний для підтримання стійкості до традиційних протипухлинних препаратів. Продемонстровано, що стійкість клітин 4Т1 RukUp до дії екзогенного плазміногену супроводжується активацією антиоксидантних систем, а резистентність до впливу каліксарену С-1011, ймовірно, забезпечується низьким мембранним потенціалом мітохондрій. Також, було продемонстровано, що протипухлинних ефект комплексів рослинних алкалоїдів з фулереном С60 на клітини лінії LLC супроводжувався зниженням рівня експресії Ruk/CIN85.
Висновки. Одержані дані свідчать про те, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 слугує системним регулятором транскриптомного й метаболічного репрограмування карциномних клітин, асоційованого з посиленням рухливості й стійкості пухлинних клітин до протипухлинних чинників.