Шановні колеги, вітаю Вас! Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України «Актуальні проблеми сучасної біохімії» продовжує свою роботу. 3-го жовтня (вівторок) 2023 р. о 10-30 в Актовій залі Інституту будемо слухати доповідь аспіранта відділу структури і функції білка Інституту Грабовського О.О. «Структура, функції та молекулярні механізми інгібування активних сайтів ключових протеїнів гемостазу». Мова йде за апробацію дисертації на здобуття вченого ступеня доктора філософії. Традиційно до цього інформаційного листа додаємо авторські тези доповіді.
При цьому повідомляємо, що прийняти участь у роботі семінару можна буде й у дистанційному форматі відповідно до наступної адреси:
https://meet.google.com/czo-nzcq-moq
Запрошуємо Вас до участі у роботі нашого семінару.
З повагою- С.О.Костерін
АВТОРСЬКІ ТЕЗИ
Структура, функції та молекулярні механізми інгібування активних сайтів ключових протеїнів гемостазу.
Доповідач: Грабовський О.О., пров. інженер відділу структури і функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
e-mail:
Актуальність. Система гемостазу – сукупність судинних, тромбоцитарних і гуморальних компонентів плазми крові, які забезпечують швидку зупинку кровотечі при пошкодженні судини. Порушення регуляції та надмірна активація тромбіну в кровотоці призводить до внутрішньосудинного формування полімерного фібрину і – як наслідок – тромбозів.
Вивчення молекулярних механізмів тромбоутворення є актуальним завданням біохімії, а пошук шляхів ефективного запобігання утворенню тромбу в судині – важливе питання сучасної медицини та біохімії. Тому метою роботи було дослідження структури, функцій та способів інгібування сайтів міжмолекулярних взаємодій таких ключових сайтів/мішеней: центрів полімеризації фібриногену, активного центру фактора Ха та урокінази.
Методологія дослідження. Для досягнення поставлених цілей методами хроматографії, що розділяє за розміром, турбідиметрії та електронної мікроскопії вивчали комплексоутворення фібрину з продуктами гідролізу фібрин(оген)у, ефекти поліпептидів (структурних аналогів суперспірального регіону молекули фібрину), а також низькомолекулярних сполук калікс[4]аренового ряду на процес полімеризації фібрину.
Методами ензиматичного аналізу, коагулометрії та агрегатометрії вивчали інгібіторну дію низькомолекулярних сполук з бібліотеки, створеної in silico, на акивність фактора Ха in vitro. Крім того, апробували обрані сполуки-інгібітори in vivo за умов внутрішньовенного введення щурам. З використанням підходів клітинної біології досліджували дію низькомолекулярних сполук з бібліотеки, створеної in silico, на активність урокінази. Перевіряли обрані сполуки на моделі міграції клітин у культурі.
На всіх етапах досліджень для верифікації отриманих результатів застосовували молекулярний докінг та молекулярну динаміку, що дозволяють встановити структури протеїн-ліганд або протеїн-протеїнових комплексів і охарактеризувати взаємодії між ними.
Результати. Отримано потрійний комплекс молекули фібрину desAB, D-димеру і D-фрагменту. Встановлено, що взаємодію між фібрином і D-димером в основному опосередковано взаємодією між центрами полімеризації “А” - “а”, в той час як D-фрагмент зв’язується з фібрином завдяки центрам полімеризації “B”. На основі отриманих даних було побудовано нову модель галуження протофібрил, яка полягає в тому що “B”-центр полімеризації (Вβ15-18), який належить молекулі фібрину першої протофібрили, зв’язується з D-регіоном фібрину другої протофібрили.
Вперше досліджено міжмолекулярні взаємодії низки сполук калікс[4]аренового ряду з молекулою фібрину. За допомогою молекулярного докінгу та динаміки встановлені ключові взаємодії між цими лігандами та N-кінцевою частиною Аα-ланцюга фібрину, що пояснює інгібіторний вплив на першу стадію полімеризації. Додатково було розраховано енергію зв’язування, що підтверджує отримані нами експериментальні результати про відмінність в активності сполук залежно від кількості залишків бісфосфонової кислоти.
Вперше було досліджено і пояснено вплив пептидів, що імітують послідовності суперспіральної ділянки молекули фібрину, на полімеризацію фібрину. Показано вплив пептидів окремо та у суміші на продовження lag-фази полімеризації фібрину, встановлено сайт зв’язування пептидів та структуру цих комплексів.
Проведено віртуальний скринінг інгібіторів фактора Ха та урокіназного активатора плазміногену та перевірено їх активність за допомогою хромогенних субстратів. Було досліджено вплив інгібіторів фактора Ха на агрегацію тромбоцитів, зсідання збагаченої тромбоцитами плазми крові людини під дією реагенту АЧТЧ та in vivo. Для інгібітора урокінази було досліджено його вплив на проліферацію пухлинних клітин MDA-MB-231.
Висновки. Поєднання експериментальних підходів in vitro з технологіями in silico дозволили дослідити молекулярні механізми функціонування окремих сайтів молекули фібрин(оген)у та запропонувати молекулярні інгібітори, здатні взаємодіяти з ними, пригнічуючи полімеризацію фібрину. З використанням аналогічних підходів запропоновано та апробовано високоефективні інгібітори урокінази та фактора Ха.